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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39837
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/3983/


Lokalisation und Quantifizierung der RNAs des European mountain ash ringspot-associated virus (EMARAV) i n der Eberesche (Sorbus aucuparia L.)

Localisation and quantification of the RNAs of the European mountain ash ringspot-associated virus (EMARAV) in mountain ash (sorbus aucuparia L.)

Schlatermund, Nanette

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SWD-Schlagwörter: Real time quantitative PCR , RNS-Viren , Eberesche , In situ
Freie Schlagwörter (Deutsch): einzelsträngiges Virus, Bunyaviridae
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mühlbach, Hans-Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 11.02.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Das European mountain ash ringspot-associated virus (EMARAV) ist ein neuartiges, bislang noch nicht klassifiziertes RNA-Virus, das eine gewisse Verwandtschaft zur Familie der Bunyaviridae, die sowohl phytopathogene als auch tier- und humanpathogene Vertreter beinhaltet, zeigt. Der einzige derzeit bekannte Wirt von EMARAV ist die in Europa beheimatete Eberesche Sorbus aucuparia L.. Diese zeigt assoziiert mit der Virusinfektion, eine chlorotische Scheckung der Blätter sowie charakteristische chlorotische Ringflecken. Das Genom von EMARAV besteht aus vier einzelsträngigen RNAs von negativer ( )Orientierung, die jeweils ein einziges virales Protein kodieren. Die längste RNA, RNA1 (7040 nt), trägt das Gen für die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die kleineren RNAs kodieren einen putativen Glykoproteinprecursor (RNA2, 2335 nt), das Nucleocapsid(N)-Protein (RNA3, 1560 nt) sowie ein 27 kDa Protein P4 mit bislang unbekannter Funktion (RNA 4, 1348 nt).
Um Erkenntnisse über den Replikationsverlauf des Virus sowie die Lokalisatin in seinem Wirt S. aucuparia L. zu erhalten, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei verschiedene Nachweisverfahren, die in situ-RT-PCR und die quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR), eingesetzt. Beide hoch sensitiven Techniken wurden bislang noch nicht für Untersuchungen an dieser Baumart, die reich an inhibitorischen Sekundärstoffen ist, eingesetzt und mussten daher zunächst aufwendig etabliert werden. In den in situ-Experimenten konnte gezeigt werden, dass EMARAV bzw. seine genomischen (vg)RNAs anscheinend keinerlei Zellspezifität besitzen, so wurden Amplifikate in den verschiedensten Zelltypen von Blättern und Blattstielen nachgewiesen und unterstützen somit vorangegangene Ergebnisse der in situ-Hybridisierung. Zudem konnte eine Lokalisierung der vgRNA in Phloemzellen nachgewiesen werden. Zur Quantifizierung der verschiedenen vRNAs wurde die qRT-PCR eingesetzt. Da hierbei für viele Fragestellungen ein interner Standard, d. h. ein konstitutiv exprimiertes Gen, eingesetzt wird, wurden für die Eberesche zunächst Genabschnitte verschiedenster potentieller Standardgene (Actin, Tubulin, eine Untereinheit der RNA-Polymerase II, 18S rDNA, Ubiquitin) kloniert und zur Ableitung geeigneter Primerpaare sequenziert. Eine Untersuchung der Expression dieser Gene über den gesamten Jahresverlauf an drei im Freiland stehenden Ebereschen ergab für keines dieser Gene ein vollkommen stabiles Expressionsniveau. Darüber hinaus mussten für fast jedes Gewebe und jeden untersuchten Baum verschiedene Standards gewählt werden.
Die Untersuchung der viralen RNAs ergab, dass die vgRNA-Konzentrationen in Blättern bzw. Knospen ein relativ gleich hohes Niveau während des Jahres zeigten. Lediglich im Frühling und Sommer ist ein leichter Anstieg zu verzeichnen. Im Bast zeigten sich hingegen stärkere Schwankungen der RNA-Mengen, wobei sich keinerlei jahreszeitliche Tendenz erkennen ließ. So waren sowohl im Winter als auch im Sommer höhere als auch manchmal geringere Mengen an vgRNA nachzuweisen. Ferner war für die Wintermonate, der Ruhephase des Baumes, kein großer Unterschied bezüglich der Konzentrationen im Bast und in den ruhenden Blattknospen zu sehen, demnach scheint das Virus in beiden Gewebe zu überdauern. Auffällig ist jedoch, dass innerhalb der verschiedenen RNAs stets die RNA2 in den höchsten Mengen vorlag. Dies galt nicht nur für die vgRNA2 sondern auch für die glykoprotein-kodierende copy(vc)RNA2, was eine höhere Affinität der RdRp zu diesen RNA-Enden vermuten lässt. Der Vergleich der Konzentrationen von (-)vgRNA zu (+)vcRNA zeigte für alle EMARAV-RNAs einen bis zu 30-fachen Überschuss der genomischen RNA und ähnelt somit anderen (-)RNA-Viren. Die Frage inwieweit die unterschiedlichen Blattsymptome Scheckung und Ringflecken auf verschiedene EMARAV-Konzentrationen zurückzuführen sind, konnte ebenfalls mit Hilfe der qRT-PCR geklärt werden. Hier zeigten sich keine signifikanten Unterschiede, d.h. in Blattbereichen verschiedener Symptomatik wurden stets gleiche Mengen an vRNA detektiert. Hingegen zeigten Blätter ohne Symptome infizierter Ebereschen eine deutlich geringere vRNA-Konzentration, was die Hypothese der Assoziation von EMARAV mit der Symptomausprägung unterstützt.


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