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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-40324
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4032/


Transport und Funktion adhäsiver Proteine des Malariaerregers Plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Transport and function of adhesive proteins of the malaria pathogen plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Treeck, Moritz

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Basisklassifikation: 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Tannich, Egbert (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.01.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 04.03.2009
Kurzfassung auf Englisch: Malaria ist eine oft tödlich verlaufende Erkrankung, die durch einen Einzeller der Gattung Plasmodium hervorgerufen wird. Die Pathologie im Menschen wird hauptsächlich durch die intrazelluläre Lebensweise des Erregers in den roten Blutkörperchen, den Erythrozyten, hervorgerufen. Die invasive Form des Parasiten, der Merozoit, invadiert den Erythrozyten und bildet bis zu 32 Tochterzellen. Diese werden durch Ruptur der Wirtszelle entlassen und können neue Erythrozyten invadieren. Im apikalen Bereich der Merozoiten befinden sich sekretorische Organellen (Rhoptrien und Mikronemen), die während der Invasion Proteine auf die Merozoitenoberfläche oder in den interzellulären Spalt zwischen Erreger und Wirtszelle sekretieren. Wie diese, für die Invasion wichtigen Proteine, in die sekretorischen Organellen transportiert werden ist nicht bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte erforscht werden, welchen Einfluss die zytoplasmatischen Domänen von ausgesuchten Typ I Transmembranproteinen der Mikronemen auf den zielgerichteten Transport in die Organellen und für die Invasion von Erythrozyten hat.

Durch Deletionen des kodierenden Bereiches der zytoplasmatischen Domänen einiger Mikronemenproteine konnte festgestellt werden, dass weder die Proteine der „Erythrocyte Binding Antigen“ Familie (EBA-175, EBA-140, EBA-181), noch das „Apical Membrane Antigen-1“ (AMA-1) von zytoplasmatischen Sequenzmotiven zielgerichtet in die Mikronemen dirigiert werden. Vielmehr konnte anhand von EBA-175 gezeigt werden, dass der Transport über eine konservierte, Cystein-reiche, luminale Domäne vermittelt wird. Dies wurde durch die Verwendung von episomal exprimierten Minigenen ermittelt, die unterschiedliche Domänenkombinationen von EBA-175 als GFP-Fusionsprotein im Parasiten exprimieren. Zusätzlich konnte mit verschiedenen Promotoren gezeigt werden, dass eine zeitlich korrekte Expression der Mikronemenproteine innerhalb der asexuellen Blutphase eine Voraussetzung für den korrekten Transport darstellt.
Das für die Invasion essentielle AMA-1 wurde als GFP-Fusionsprotein in Parasiten exprimiert, um dessen Lokalisation, Dynamik und Funktion im Invasionsprozess zu analysieren. AMA-1 wird kurz vor der Invasion auf die Oberfläche von Merozoiten verteilt, wobei eine apikale Konzentration beobachtet werden kann. Wie diese beiden Populationen physisch und funktionell im Zusammenhang stehen ist nicht bekannt. Mit Hilfe von FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) und FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Analysen konnten zwei AMA-1 Populationen auf der Oberfläche der Merozoiten unterschieden werden: i) Eine periphere, mobile Fraktion, die an der Reorientierung des Merozoiten beteiligt sein könnte und ii) eine apikale, weniger mobile Fraktion, die an der Bildung einer intimen Zell-Zellverbindung (moving junction) beteiligt sein könnte. Durch ein synthetisches Peptid, welches spezifisch an eine hydrophobe Tasche in der AMA-1 Ektodomäne bestimmter Parasiten-Isolate wie 3D7 (nicht aber an W2mef) bindet und die Reinvasion von 3D7-Parasiten in Erythrozyten spezifisch inhibiert, konnte durch Lebendvideomikroskopie die Inhibition der Invasion in Echtzeit dargestellt werden. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung der hydrophoben Tasche von AMA-1 nicht die initiale Bindung oder Reorientierung an den Erythrozyten beeinflusst, aber das aktive Eindringen in die Wirtszelle verhindert, was auf eine Funktion bei der „moving junction“ Ausbildung kurz vor der Invasion hindeutet.
Auf dieser Basis wurde ein Komplementationsassay etabliert, bei dem in 3D7-Parasiten episomal W2mef-AMA-1 exprimiert wurde. Das ermöglichte erstmals die funktionelle Analyse von AMA-1 auf molekularer Basis, da episomal exprimiertes W2mef-AMA-1 die Funktion von endogenem 3D7-AMA-1 komplementieren kann. Dies konnte in Reinvasionsassays quantifiziert werden. Durch die Einführung von gezielten Mutationen in die zytoplasmatische Domäne des episomalen W2mef-AMA-1 konnten direkt die Auswirkungen der Mutationen an der Komplementationsfähigkeit gemessen werden. So führte die Deletion sowie die Substitution verschiedener konservierter Aminosäuren inklusive 6 putativer Phosphorylierungsstellen in der zytoplasmatischen Domäne zur kompletten, funktionellen Inaktivierung von AMA-1, obwohl der Transport in die Mikronemen nicht beeinträchtigt war. Die Phosphorylierung des essentiellen AMA-1 Proteins könnte sich als eine Achillesferse des Parasiten herausstellen. Die Identifikation und Charakterisierung der verantwortlichen Kinase(n) eröffnet damit die Möglichkeit einer neuen, innovativen Strategie zur Bekämpfung der Malaria.

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