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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-40342
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4034/


Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Fettsäure-delta-3(E)-Desaturasen aus Fusarium graminearum Schwabe und Magnaporthe grisea (T. T. Hebert) M. E. Barr und einer Fettsäure-beta-Hydroxylase aus Cytophaga hutchinsonii Winogradsky

Identification and functional characterisation of fatty acid delta-3(E)-desaturases from Fusarium graminearum Schwabe and Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr and a fatty acid beta-hydroxylase from Cytophaga hutchinsonii Winogradsky

Zäuner, Simone

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Basisklassifikation: 42.13 , 42.41
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Warnecke, Dirk (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2008
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 11.03.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Delta-3(E)-ungesättigte Fettsäuren sind charakteristische Bestandteile der Glucosylceramide (GlcCer) von Euascomyceten. Zu dieser basalen Gruppe hyphaler Pilzen gehören auch viele human- und phytopathogene Arten. In dieser Arbeit konnte für den Getreide-pathogenen Pilz Fusarium graminearum gezeigt werden, dass der relative Anteil delta-3(E)-ungesättigter Fettsäuren im GlcCer bei niedrigen Temperaturen am höchsten ist und bei Temperaturen über 28°C stark abnimmt. Die generelle Funktion der Doppelbindung ist jedoch noch unbekannt.
Die Gene bzw. Proteine, die für die Einführung der Doppelbindung verantwortlich sind, waren nicht bekannt und wurden erst in dieser Arbeit beschrieben und funktionell charakterisiert: Durch Adaptation des von Ternes et al. (J. Biol. Chem., 2002) entwickelten bioinformatischen Ansatzes wurde eine neue Protein-Familie identifiziert, die alle charakteristischen Merkmale membrangebundener Desaturasen aufweist. Zudem erfüllt sie alle anderen notwendigen Bedingungen einer Kandidatenfamilie von delta3(E)-Desaturasen. Diese Sequenzen wurden funktionell als Sphingolipid-delta3(E)-Desaturasen identifiziert. Dies geschah zunächst durch Erzeugung einer Gendeletionsmutante von Fusarium graminearum, deren GlcCer keine delta-3-Doppelbindung mehr enthält. Um nachzuweisen, dass die identifizierte Sequenz tatsächlich für die Desaturase codiert, wurden die Sequenzen aus Fusarium graminearum und Magnaporthe grisea heterolog in der Hefe Pichia pastoris exprimiert. P. pastoris synthetisiert GlcCer, dessen Struktur mit Ausnahme der fehlenden delta-3(E)-Doppelbindung identisch zu dem aus F. graminearum ist, weshalb die Hefe als geeignetes Expressionssystem erachtet wurde. Aus P. pastoris-Zellen, welche die putativen delta-3(E)-Desaturasegene aus F. graminearum und M. grisea exprimierten, konnte GlcCer isoliert werden, das eine trans-Doppelbindung am C3 der Fettsäure enthält. Die Struktur des GlcCer (Position und Konfiguration der Doppelbindung) wurde mit ESI-FT-ICR-MS und NMR-Spektroskopie bestätigt.
Es ist bekannt, dass GlcCer als Angriffspunkt für verschiedene pflanzliche Defensine (kleine basische Peptide) dient, die das Wachstum von Pilzen hemmen. Der genaue Interaktionsmechanismus ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch die Modifikationen am Ceramid-Grundgerüst (=> delta-3(E)-Doppelbindung) einen Einfluss auf die wachstumshemmende Aktivität der Defensine RsAFP2 (aus Raphanus sativus) und AgAFP (aus Aspergillus giganteus) haben: Die Mutante von F. graminearum, deren Δ3-Desaturase deletiert wurde, wird resistent gegen beide Defensine. Hingegen sind Zellen von P. pastoris, welche die delta-3(E)-Desaturase aus F. graminearum exprimieren, stärker sensitiv als Zellen des Wildtyps.
Neben den Sequenzen aus Euascomyceten enthielt die Desaturase-Familie auch Sequenzen aus Bakterien (Cytophaga hutchinsonii, Plesiocystis pacifica) und Grünalgen (Chlamydomonas reinhardtii, Ostreococcus tauri und O. lucimarinus). Das Kandidatengen aus Cytophaga hutchinsonii codiert für eine Fettsäure-C3-Hydroxylase, die im Bakterium selbst wohl Sulfosphingolipide hydroxyliert, in Pichia aber neben GlcCer auch Phosphoglycerolipide als Substrate akzeptiert.

In dieser Arbeit wurde die erste delta-3(E)-Desaturase kloniert. Die hergestellten Deletions- und Expressionsmutanten ermöglichen zukünftige Untersuchungen zu biologischen Funktionen delta-3(E)-desaturierter Fettsäuren. Besonders zu erwähnen sind hier eine mögliche Signalfunktion delta-3(E)-desaturierter Sphingolipide in F. graminearum (Grad der Desaturierung ist abhängig von der Wachstumstemperatur), ein Einfluss auf die Pathogenität des Pilzes und ihre Bedeutung für die Interaktion mit Defensinen.

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