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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-41150
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4115/


Untersuchungen zur Struktur und Funktion des interzellulären Polysaccharid-Adhäsins (PIA) in Staphylococcus epidermidis Biofilmen

Investigations into structure and function of the polysaccharide intercellular adhesin (PIA) in Staphylococcus epidermidis biofilms

Frankenberger, Stephanie Karin

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Interzelluläres Polysaccharid-Adhäsin , Staphylococcus epidermidis , Biofilm
Freie Schlagwörter (Englisch): Polysaccharide intercellular adhesin , Staphylococcus epidermidis , biofilm
Basisklassifikation: 44.43
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pommerening-Röser, Andreas (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.11.2008
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 28.04.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Das interzelluläre Polysaccharid-Adhäsin (PIA) von S.epidermidis ist ein essentieller Faktor für die Biofilmakkumulation, dem wichtigsten Virulenz Faktor im Kontext Fremdkörper-assoziierter Infektionen. Das PIA ist ein homopolymer aus ß-(1,6)-verknüpften N-Acetylglukosamin (GlcNAc) Einheiten. PIA ist ein zentraler Bestandteil der von S. epidermidis gebildeten extrazellulären Biofilmmatrix. Diese stabilisiert nicht nur die mehrlagige Biofilmarchitektur, sondern schützt S. epidermidis auch vor Angriffen durch das Immunsystem. Interessant ist Deacetylierung eines signifikanten Anteils der GlcNAc Reste, durch welche eine positive Nettoladung des Polymers resultiert, welche wiederum funktionell für die Biofilmbildung wie auch den PIA-vermittelten Schutz vor Effektoren der angeborenen Immunität notwendig ist (Vuong, 2004b). Die exakten Determinanten insbesondere der interzellulär adhäsiven Funktion von PIA sind jedoch bislang nicht bekannt.
Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war es, durch die strukturelle Charakterisierung einer durch S. epidermidis 939 gebildeten hypothetischen serologischen Variante von PIA (PIAv) und den Abgleich mit PIA des S. epidermidis Referenzstamms 1457 Erkenntnisse über Struktur-Funktionsbeziehungen von PIA bei der S. epidermidis Biofilmbildung zu erhalten. S. epidermidis 939 zeichnet sich durch einen stark Biofilm-positiven Phänotyp bei nur schwacher Reaktivität mit einem spezifischen anti-PIA-Antiserum aus.
In phänotypischen Untersuchungen zur Stabilität des Biofilms gegenüber der Aktivität des PIA-spaltenden Enzyms DspB und Trypsin konnte gezeigt werden, dass bei S. epidermidis 939 wie auch S. epidermidis 1457 PIA oder ein nahe verwandetes Molekül funktionell an der Ausprägung eines biofilmpositiven Phänotyps ist. Durch die serologische Charakterisierung von S. carnosus TM300 nach in trans Expression von icaADBC des Stamms 1457 oder 939 kann gezeigt werden, dass Punktmutationen in icaA des Stamms 939 keinen Einfluss auf die Substratspezifität der hier kodierten N-Acetyglukosaminyltransfrase haben. Somit werden mögliche Modifikationen von PIA des Stamms 939 sekundär in das Molekül eingeführt.
Durch die Optimierung von Wachstumsbedingungen war es möglich, relevante Mengen extrazellulärer Biofilmmatrix des Stamms 939 zu gewinnen und deren Bestandteile durch GPC und AEC weiter aufzureinigen. Das komplexe Stoffgemisch der extrazellulären Biofilmmatrix der Stämme S. epidermidis 1457 und 939 weisen in der Gelpermeationschromatographie das gleiche Elutionsverhalten auf. In der Anionenaustauschchromatographie jedoch lässt sich das durch GPC gewonnene Material des Stamms 939 in drei immunreaktive peaks A-C trennen, bei S. epidermidis 1457 konnten hingegen nur peaks A und B nachgewiesen werden. Dabei handelt es sich um eine neutrale (A), eine schwach anionische (B) und bei S. epidermidis 939 um eine stark anionische (C) Fraktion. Im peak C kann, trotz der Immunoreaktivität mit anti-PIA-Antiserum, nicht wie bei peak A und B Hexosamin durch biochemische Verfahren dargestellt werden. Bei peak A handelt es sich bei S. epidermidis 939 wie auch 1457 um PIA. Die strukturelle Analyse von peak B zeigt keinen wesentlichen Unterschied zwischen S. epidermidis 939 und 1457, bei den isolierten Strukturen handelt es sich um die wall teichoic acid (WTA), jedoch nicht wie erwartet um ß-(1,6)-N-Acetylglukosamin. Die strukturelle Analyse des peaks C identifizierte Lipoteichonsäure (LTA) als zusätzliche Komponente im Biofilmmatrixextrakt von S. epidermidis 939.
Die Ergebnisse zeigen, dass offensichtlich S. epidermidis 939 wie auch 1457 PIA bildet, welches sich hinsichtlich seiner Eigenschaften in GPC und AEC nicht von PIA des Stamms 1457 unterscheidet. Die Unterschiede in der Zusammensetzung der Biofilmmatrix zwischen S. epidermidis 939 und 1457 könnten die Beobachtung eines stark biofilmpositiven Phänotyps trotz geringer PIA-Synthese bei S. epidermidis erklären.
Durch den Einsatz des gelfiltrierten PIAv als Ligand im „phage-display“ System ist neben verschiedenen Proteinen ein Fragment des YpfP Proteins identifiziert worden. Eine Diacylglycerol Glucosyltransferase, die für die Biosynthese von Glykolipid der LTA verantwortlich ist. Des weiteren ist das Fragment eines Oberflächenproteins, Embp identifiziert worden. Embp ist an der Entstehung von S. epidermidis Biofilmen beteiligt und besitzt eine FIVAR (found in various architectures) Domäne, die in anderen Organismen N-Acetylglukosamin-bindende Aktivität aufweist.
Die hier vorgestellten Ergebnisse motivieren einer weitere Analyse der Wechselwirkung zwischen Teichonsäuren und PIA. Außerdem wird der Hinweis auf eine potentielle Verbindung von Embp und PIA gestützt.


Kurzfassung auf Englisch: The intercellular polysaccharid adhesin (PIA) from S. epidermidis is an essential factor for biofilmaccumulation, the most important virulence factor in the context of device-associated infections. PIA is a linear homoglycan, consisting of ß-(1,6)-linked N-acetylglucosamin (GlcNAc) residues. This carbohydrate is the central component of the extracellular produced biofilmmatrix, synthesized by S. epidermidis. PIA not only stabilizes the multilayered biofilmarchitecture, but it also defends S. epidermidis from immune invasion. What is interesting is the deacetylation of a significant rate of the GlcNAc moiety, which results in a positive charge of the polymer, which is necessary for functional biofilm formation, as well as PIA-dependent protection from innate immunity (Vuong, 2004b). At the moment, an exact determination of, above all, the intercellular adhesive function of PIA is completely unknown.
In this study, the main aim was to gain information about the structure-function-relation of PIA in biofilm formation via the structural characterization of a hypothetical serological variant of PIA (PIAv) produced by S. epidermidis 939 and a comparison with PIA from the reference strain S. epidermidis 1457. S. epidermidis 939 is characterized by a strong biofilm-positive phenotype with poor reactivity to the specific anti-PIA-antiserum.
Analysis of the stability of the biofilm compared with the PIA-cleaving enzyme DspB and Trypsin showed that PIA from S. epidermidis 939 and 1457 or a closely related molecule is functionally involved in a biofilm-positive phenotype. By means of a serological characterization of S. carnosus TM300, in accordance with the trans expression of icaADBC from strain 1457 or 939, it can be shown that punctual mutations in the space of icaA from 939 have no influence on the substrate specificity of the N-acetylglucosamin transferase coded here. In conclusion, all PIA modifications must be a secondary process. By optimizing the growth conditions, it was possible to extract relevant quantities of extracellular biofilmmatrix of the strain 939 and to further purify their constituents with GPC and AEC. The extract of S. epidermidis 1457 and 939 had the same behaviour in elution at the GPC. However, AEC purification separates GPC-eluate from S. epidermidis 939 into three immunoreactive, detectable peaks A-C, whereas for S. epidermidis 1457 it only displays peaks A and B. These refer to a neutral (A), a poor anionic (B) and, for S. epidermidis 939, a strong anionic (C) fraction. Unlike in peak A and peak B, hexosamine was not detectable by biochemical methods in peak C. Peak A applies to S. epidermidis 939 as well as 1457 PIA. There was basically no difference in the structural analysis of peak B between S. epidermidis 939 and 1457; although the isolated structures referred to wall teichoic acid (WTA), unlike the ß-(1,6)-linked N-acetylglucosamin, as expected. The structural analysis of peak C identified lipoteichoic acid (LTA) as an added component in the biofilmmatrixextract of S. epidermidis 939.
These results clearly showed that S. epidermidis 939 as well as 1457 synthesize PIA, without characteristic differences regarding the purification by GPC and AEC. Maybe this is an explanation for the observance of a strong biofilm-positive phenotype in spite of less PIA synthesis.
A fragment of YpfP protein, among others, was found by phage display screening with PIAv as ligand. The glycolipid biosynthesis from LTA takes place against this glycolipid diacylglycerol glucosyltransferase. Furthermore, an Embp surfaceprotein fragment was isolated. Embp is involved in S. epidermidis biofilm development and offers a FIVAR (found in various architectures) domain, which in other organisms exhibits binding activity to N-acetylglucosamin.
The results presented here motivate further analysis of the relationship between teichoic acid and PIA. Moreover, they support indications to a potential connection between Embp and PIA.

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