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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-41397
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4139/


Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem neuralen Zelladhäsionsmolekül NCAM und dem multiple PDZ-Domänen-enthaltenden Protein MUPP1 im Nervensystem der Maus (Mus musculus, Linné 1758)

Investigation of the interaction between the neural cell adhesion molecule NCAM and the multi-PDZ domain protein MUPP1 in the nervous system of the mouse (Mus musculus, Linné 1758)

Novak, Daniel

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SWD-Schlagwörter: Neurales Zell-Adhäsionsmolekül , Kaliumkanal Kir3.2
Freie Schlagwörter (Deutsch): PDZ-Domänen , Protein-Protein-Interaktion
Freie Schlagwörter (Englisch): PDZ-domains , protein-protein interaction
Basisklassifikation: 42.99
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.02.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 09.06.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM, ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, beeinflusst die Proliferation und Migration neuraler Zellen. Auch beim Neuritenwachstum, der Axonbündelung und der Ausbildung sowie der Plastizität von synaptischen Kontakten spielt NCAM eine wichtige Rolle. Die beiden Isoformen NCAM180 und NCAM140 (benannt nach ihren molekularen Massen von 180 bzw. 140 kDa) enthalten ein putatives PDZ-Bindemotiv an ihren C-Termini.
Das multiple PDZ-Domänen-enthaltende Protein MUPP1 zeichnet sich durch 13 spezielle Protein-Protein-Interaktionsdomänen, die PDZ-Domänen, aus. Aus Crosslinking- und Co-Immunpräzipitations-Experimenten mit Gehirnhomogenat und transient transfizierten Zellen war bekannt, daß MUPP1 und NCAM180 assoziiert sind. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Interaktion zwischen NCAM und MUPP1 biochemisch zu charakterisieren.
Um die putative Bindung von MUPP1 an NCAM zu untersuchen, wurde zunächst MUPP1 in einzelne Abschnitte unterteilt, die jeweils eine PDZ-Domäne umfassen. Diese wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert. Die intrazellulären Domänen von NCAM140 (NCAM140 ID) bzw. NCAM180 (NCAM180 ID) wurden als His-Fusionsproteine exprimiert. Als Test auf direkte Interaktion wurden ELISA-Experimente durchgeführt. Anhand dieser Tests konnte die direkte Interaktion bestätigt und die 10. PDZ-Domäne von MUPP1 als NCAM-bindender Teil des Moleküls identifiziert werden.
Des Weiteren konnte per ELISA ausgeschlossen werden, daß das C-terminale putative PDZ-Bindemotiv von NCAM an der Wechselwirkung mit MUPP1 beteiligt ist.
Unter Einsatz eines NCAM140 ID-Konstrukts, dessen N-terminales Drittel deletiert wurde, konnte gezeigt werden, daß dieser Bereich des Proteins essentiell für die Interaktion ist. Durch die Deletion des N-Terminus wurde die Interaktion zwischen MUPP1 und NCAM140 ID unterbunden.
Wie seit längerem bekannt ist, reguliert NCAM die Oberflächenlokalisation der neuronalen, einwärtsgleichrichtenden, G-Protein-aktivierten Kaliumkanäle (Kir), bestehend aus zwei Kir3.1- und zwei Kir3.2-Untereinheiten, über einen bisher unbekannten Mechanismus. Kir-Kanäle spielen eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotentials, der Regulation des Aktionspotentials, der Rezeptor-abhängigen Kontrolle der zellulären Erregbarkeit und der K+-Homöostase. Wie frühere Untersuchungen gezeigt haben, interagieren Kir3.1 und Kir3.2 nicht direkt mit NCAM. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mittels ELISA gezeigt werden, daß die Kir3.2-Untereinheit direkt an die 13. PDZ-Domäne von MUPP1 bindet.
Hieraus ergab sich die Arbeitshypothese, daß MUPP1 die Verbindung zwischen NCAM und Kir3.2 herstellen könnte. Vorstellbar wäre, daß NCAM die Oberflächenlokalisation der neuronalen Kir-Kanäle reduziert, indem es an MUPP1 bindet und dadurch gleichzeitig die Wechselwirkung zwischen MUPP1 und Kir3.2 beeinflusst.
Um diese Hypothese zu testen, wurden Neurone aus dem Hippocampus von Mäusen präpariert und mit einem Kir3.1/3.2-Fusionskonstrukt und verschiedenen GFP-markierten MUPP1-Konstrukten, die jeweils eine einzige PDZ-Domäne umfassen, transfiziert. Durch Überexpression der 10. PDZ-Domäne von MUPP1 sollte die Interaktion von NCAM mit endogenem MUPP1 unterbunden und dadurch die Menge von neuronalen Kir-Kanälen an der Zelloberfläche erhöht werden. Die Menge von Kir3.1/3.2 an der Zelloberfläche wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Es zeigte sich, daß die Blockierung der Interaktionen der 1. und 10. PDZ-Domäne von MUPP1 die Menge an Kir3.1/3.2 an der Zelloberfläche signifikant erhöht. Dies spricht dafür, daß MUPP1 an der Regulation der Oberflächenlokalisation von Kir-Kanälen in Neuronen beteiligt ist.
Kurzfassung auf Englisch: The neural cell adhesion molecule NCAM, a member of the immunoglobulin-superfamily, influences proliferation and migration of neural cells. Moreover it plays an important role in neurite outgrowth, axon fasciculation and the formation and plasticity of synaptic contacts.
The two isoforms NCAM180 and NCAM140 (named according to their molecular weights of 180 and 140 kD respectively) contain a putative PDZ-binding motif at their C-termini.
The multi-PDZ domain protein MUPP1 is characterised by 13 special protein-protein-interaction domains, the PDZ domains. From crosslinking and co-immunoprecipitation experiments with brain homogenate and transiently transfected cells it was known that MUPP1 and NCAM180 are associated with each other. The aim of this work was to characterise the interaction between NCAM and MUPP1 biochemically.
In order to investigate the putative binding of MUPP1 to NCAM, MUPP1 was subdivided into smaller fragments each bearing one single PDZ domain. These have been expressed as GST fusion proteins. The intracellular domains of NCAM140 (NCAM140 ID) and NCAM180 (NCAM180 ID) have been expressed as His-tagged fusion proteins. By means of ELISA experiments an interaction between the 10th PDZ domain of MUPP1 and NCAM could be verified.
Furthermore it could be excluded that the C-terminal putative PDZ-binding motif of NCAM plays a role for this interaction.
Experiments with a construct of NCAM140 ID whose N-terminal third had been deleted pointed out that this part of the molecule seems to be essential for the binding to MUPP1. The deletion abolished the interaction completely.
It is known that NCAM regulates the cell surface localisation of the neuronal inwardly rectifying G-protein-coupled potassium channels (Kir), consisting of two Kir3.1 and two Kir3.2 subunits via a yet unknown mechanism. Kir channels are involved in the maintenance of resting potential, regulation of action potential, receptor-mediated control of cellular excitability and K+ homeostasis. Previous experiments had shown that Kir3.1 and Kir3.2 do not interact directly with NCAM. Within this work it could be confirmed via ELISA that Kir3.2 directly binds to the 13th PDZ domain of MUPP1.
From this finding the hypothesis arose that MUPP1 might act as a mediator between NCAM and Kir3.2. It would be conceivable that NCAM reduces the cell surface localisation of neuronal Kir channels by binding to MUPP1 and thereby affecting the interaction between MUPP1 and Kir3.2.
To test this hypothesis, neurons from the hippocampus of mice had been dissected and transfected with a Kir3.1/3.2 fusion construct and several GFP-tagged MUPP1 constructs each one bearing just one single PDZ domain. Overexpression of the 10th PDZ domain of MUPP1 should abolish the interaction between NCAM and endogenous MUPP1 and thereby increase the amount of neuronal Kir channels at the cell surface. The amount of Kir3.1/3.2 at the cell surface was quantified by means of fluorescence microscopy. It appeared that blockage of the interactions of the 1st and 10th PDZ domain of MUPP1 led to a significantly increased amount of Kir3.1/3.2 at the cell surface. This finding indicates that MUPP1 is involved in the regulation of cell surface localisation of Kir channels in neurons.

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