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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-41401
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4140/


Konstruktion der Zielvektoren zur Generierung von TN-N und CHST-12 Knockout-Mäusen und Analyse der CHST-14 Knockout-Maus (Mus musculus, Linné 1758)

Construction of the targeting vectors to generate TN-N and CHST-12 knockout mice and analysis of the CHST-14 knockout mouse (Mus musculus, Linné 1758)

Nickel, Sandra

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SWD-Schlagwörter: Knockout <Molekulargenetik> , Sulfatierung , Dermatansulfat , Tenascin
Basisklassifikation: 42.99
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.02.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 08.06.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Chondroitinsulfat-Proteoglykane sind ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix und spielen unter anderem eine bedeutende Rolle bei Axonwachstum, Zell-Migration und Plastizität des Nervensystems. Die unterschiedlichen Glykosaminoglykan-Seitenketten, die diese Proteoglykane dekorieren, können durch Sulfatierung modifiziert werden. Die 4-O-Sulfatierung dieser Zucker-Seitenketten wird unter anderem durch die Mitglieder der HNK-1-Sulfotransferase-Familie katalysiert. Es sind bislang sieben Mitglieder dieser Familie bekannt (CHST-8 - CHST-14) die spezifisch unterschiedliche Kohlenhydrat-Epitope sulfatieren.
Ein Projekt dieser Arbeit bestand in der Analyse der kürzlich generierten CHST-14 Knockout-Maus (CHST-14-/- Maus). Die CHST-14-/- Mäuse waren im Vergleich zum Wildtyp kleiner, leichter und wurden mit geringerer Mendelscher Häufigkeit geboren. Neugeborene CHST-14-/- Tiere besaßen einen deformierten Schwanz, der auch bei adulten Tieren, die zweimal auf C57BL/6J-Hintergrund rückgekreuzt wurden, zu beobachten war. Eine weitere Auffälligkeit der CHST-14-/- Mäuse war die Ausbildung von Elefantenzähnen, die bei einigen Tieren unterschiedlich stark ausgeprägt waren.
Chondroitinsulfat-Proteoglykane spielen nach Verletzungen des ZNS eine entscheidende Rolle bei der Inhibierung der Regenerationsprozesse. An der Läsionsstelle kommt es zur Bildung einer Glianarbe, die reich an Chondroitinsulfat-Proteoglykanen ist und das Haupthindernis bei der Axonregeneration darstellt. Die Tatsache, dass die Applikation von Chondroitinase ABC nach Verletzungen des ZNS zu einer Verbesserung der funktionellen Regeneration führt (Moon et al., 2001; Bradbury et al., 2002, Caggiano et al., 2005), deutet darauf hin, dass der negative Einfluss nicht nur vom Kernprotein, sondern auch von den GAG-Ketten vermittelt wird.
Es wurden Rückenmarksläsionen durchgeführt und die funktionelle Regeneration der CHST-14-/- Tiere im Vergleich zu wildtypischen Geschwistern analysiert. Überraschenderweise regenerierten die CHST-14-/- Mäuse schlechter als die Wildtypen. Morphologische Untersuchungen zeigten, dass sich der Durchmesser des Rückenmarks der beiden Genotypen nicht unterscheidet und es auch bei der Größe der grauen und weißen Substanz in transversalen Rückenmarksschnitten keinen Unterschied gibt. Die monoaminerge Re-Innervierung des Rückenmarks nach der Läsion, zeigte ebenfalls keine Unterschiede.
Die differentielle Genexpression der einzelnen Mitglieder dieser Familie im Rückenmark nach Läsion wurde mittels qRT-PCR untersucht. CHST-12 zeigte als einziges Mitglied einen genotypischen Unterschied in der Expression an der Läsionsstelle, sowie rostral und caudal der Läsionsstelle und war im Knockout, im Vergleich zum Wildtyp, hochreguliert. Dies deutet auf die Kompensation des Verlusts der CHST-14 durch die CHST-12 hin, was auch die schlechtere Regeneration der CHST-14-/- Mäuse nach Rückenmarksläsion erklären könnte.
Zusätzlich wurden die CHST-14-/- Tiere verhaltensbiologisch untersucht. Es konnten keine Unterschiede im Explorations- und Angstverhalten zwischen den Genotypen festgestellt werden, jedoch war ein verringertes Neugierverhalten und eine verminderte Neugier-induzierte Exploration der CHST-14-/- Tiere zu erkennen. Die Motorkoordination der Knockouts war im Pole Test stark beeinträchtigt, während sie im Rotarod Test eine deutlich bessere Leistung als die Wildypen zeigten. Im Urin-Markierungs Test setzten die Knockouts weniger Markierungen und zeigten eine verringerte Lokomotion. Im one trial spatial learning Test wurde ein tendenziell besseres Langzeitgedächtnis der CHST-14-/- Tiere beobachtet. Da die Wildtypen in diesem Versuch jedoch eine deutlich schlechtere Leistung zeigten, als in vorherigen Versuchen und die analysierten Tiere nur zweimal auf C57BL/6J-Hintergrund rückgekreuzt wurden, müssen diese Beobachtungen durch zusätzliche Versuche nach weiteren Rückkreuzungen bestätigt werden. Des Weiteren war bei den Knockouts eine verstärkte Stressantwort im tail suspension Test zu beobachten.
Ein zweites Projekt bestand in der Konstruktion der Zielvektoren zur Herstellung einer konditionalen CHST-12 defizienten Maus und einer konstitutiven TN-N Knockout-Maus.
Auf Basis der homologen Rekombination wurde ein Zielvektor konstruiert, bei dem in das Exon 2 des CHST-12-Gens eine loxP-Erkennungssequenz und in die genomische Region 3´ von Exon 2 eine FRT/loxP-flankierte Neomycin/Kanamycin-Selektionskassette integriert wurde.
Zur Herstellung des konstitutiven TN-N Knockouts wurden die Exone 1-4 durch eine Neomycin/Kanamycin-Selektionskassette ersetzt. Der Vektor wurde zur Transfektion mausembryonaler Stammzellen (ES-Zellen) verwendet und nach G418-Selektion wurde die homologe Integration des Zielvektors in den TN-N-Lokus der resistenten ES-Zellen untersucht. Es wurden 288 Klone über PCR und Southern-Blots analysiert, doch es konnte für keinen der Klone eine erfolgreiche Rekombination nachgewiesen werden.
Kurzfassung auf Englisch: Chondroitin sulfate proteoglycans are an important component of the extracellular matrix and play a role in axonal growth, cell migration and plasticity of the nervous system. The glycosaminoglycan side chains of these proteoglycans can be further modified by sulfation. This 4-O sulfation is catalyzed by the HNK-1 sulfotransferase family. So far seven members of this family have been described (CHST-8 - CHST-14) that sulfate different carbohydrate epitopes.
One project of this thesis was the analysis of the CHST-14 knockout mouse (CHST-14-/- mouse). CHST-14-/- mice were smaller and lighter in comparison to their wildtype littermates and they were born with a reduced mendelian frequency. Newborn CHST-14-/- animals had deformed tails that were also visible in adult animals that have been backcrossed to C57BL/6J background twice. Additionally CHST-14-/- mice had elephant teeth with variable occurrence in different animals.
Chondroitin sulfate proteoglycans play an important role in the failure of axonal regeneration after CNS injuries. After CNS injury a glial scar forms which is rich in chondroitin sulfate proteoglycans. This glial scar is known to be a main cause of inhibition of axonal regeneration. As the application of Chondroitinase ABC after injury of CNS leads to better functional recovery (Moon et al., 2001; Bradbury et al., 2002, Caggiano et al., 2005) there is evidence that the inhibitory effect of the chondroitin sulfate proteoglycans is mediated through the core protein as well as through the GAG side chains.
Spinal cord injuries were performed in CHST-14 wildtype and knockout animals and the functional recovery of these animals was analyzed. In comparison to their wildtype littermates CHST-14-/- animals showed a worse recovery 6 weeks after lesion. It could be demonstrated that the diameter of the spinal cord is not different in both genotypes and there were no differences in grey and white matter in transversal spinal cord sections. Monoaminergic reinnerveration did not show any differences, too.
The differential gene expression of the members of the HNK-1 sulfotransferase family in lesioned spinal cord was analyzed via qRT PCR. Only for CHST-12 a genotypical difference in the expression at the lesion side as well as rostral and caudal of the lesion side was detected. CHST-12 expression was upregulated in CHST-14-/- mice in comparison to wildtype animals. This could be a hint that CHST-12 might compensate the loss of CHST-14, which could be an explanation for the bad functional recovery of the CHST-14-/- mice after spinal cord injury.
Additionally CHST-14-/- mice were analyzed on behavioral levels. No differences in anxiety and explorative behavior could be observed between the genotypes, but CHST-14-/- mice showed a reduced novelty seeking behavior and a reduced novelty induced exploration in comparison to wildtype mice. Motor coordination of CHST-14-/- mice was strongly impaired in the Pole test but on the contrary knockout animals had a significantly better performance in the Rotarod test in comparison to the wildtype littermates. In the Urine marking test CHST-14-/- mice showed reduced locomotion and placed less urine markings. In the one trial spatial learning test a tendency for a better long term memory of the CHST-14-/- animals was observed, but as the wildtype mice showed a worse long term memory as observed in previous studies and because the animals that were used for the behavioral analysis were only backcrossed to C57BL/6J-background twice, these observations have to be further proven. Additionally an enhanced stress response of the CHST-14-/- mice was observed in the tail suspension test.
A second project of this thesis was the construction of the targeting vectors for the generation of a conditional CHST-12 deficient mouse line and a constitutive TN-N knockout mouse line.
On the basis of homologous recombination a CHST-12 targeting vector was generated by inserting a single loxP site in exon 2 of the CHST-12 gene and a FRT/loxP-flanked neomycin/Kanamycin selection cassette 3´ of exon 2.
To generate the TN-N targeting vector exons 1-4 of the TN-N gene were replaced by a neomycin/Kanamycin selection cassette. This targeting vector was used for transfection of embryonic stem cells (ES cells). After G418 selection the homologous integration of the targeting vector into the TN-N locus of G418 resistant ES cells was verified in southern blot analysis. For none of the 288 tested ES cell clones a successful recombination could be detected.

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