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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-41876
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4187/


Quorum Quenching und Anti-Biofilm Strategien aus Metagenom - Isolierung und Charakterisierung Quorum Sensing inhibierender Proteine aus Genbanken direkt isolierter Umwelt-DNA

Schipper, Christina

Originalveröffentlichung: (2009) Schipper, C, Hornung, C, Bijtenhoorn, P, Quitschau, M, Grond, S, Streit, WR. (2009a): Metagenome-derived clones encoding for two novel lactonase family proteins involved in biofilm inhibition in Pseudomonas aeruginosa, Applied and Environmental Microbiology Vol. 75 No 1: 224-233.
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SWD-Schlagwörter: Biofilm , Metagenom , Pseudomonas aeruginosa , Inhibition , Quorum
Freie Schlagwörter (Deutsch): Quorum Sensing , Quorum Quenching , Swarming
Freie Schlagwörter (Englisch): Metagenomics
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Streit, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 10.07.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Bakterielle Zell-Zellkommunikation (Quorum Sensing) ist maßgeblich an der Biofilmbildung von Pseudomonas aeruginosa beteiligt. Aufgrund seiner zentralen Funktion für Biofilmbildung bietet QS die Möglichkeit neue Strategien zur Biofilmprävention zu entwickeln.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden daher neun neuartige Quorum Sensing inhibierende Enzyme aus bisher nicht kultivierten Mikroorganismen mit Hilfe der Metagenomik isoliert, molekularbiologisch charakterisiert und auf ihre Biofilm-inhibitorische Wirkung hin analysiert. Für vier der insgesamt gefundenen Klone konnten die für die Quorum-Quenching-Aktivität verantwortlichen Gene isoliert und die zugehörigen Proteine BpiB01, BpiB04, BpiB05 und BpiB09 heterolog überexprimiert werden. Die biochemische Charakterisierung dieser Proteine mit Hilfe der HPLC-MS-Analytik ergab, dass die QQ-Aktivität bei AHL-Molekülen auf eine Spaltung des Lactonringes zurückzuführen ist. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei BpiB01, BpiB04, BpiB05 und BpiB09 um vier völlig neue Lactonasen handelt, welche in der Lage sind, AHL-Moleküle mit unterschiedlicher Struktur zu spalten und die keinerlei Ähnlichkeiten zu bisher beschriebene Lactonasen aufweisen.

Während BpiB01, BpiB04 und BpiB09 wie alle bisher beschriebenen bakteriellen AHL-Lactonasen Zink als Cofaktoren benötigten, zeigte BpiB05 eine Abhängigkeit von Ca2+. Diese Eigenschaft wurde bisher nur für die humanen PONs beschrieben, die ebenfalls Lactonase-Aktivität aufweisen.

Weitere Analysen in P. aeruginosa zeigten, dass die Expression der bpiB-Gene mehrere QS-abhängige Phänotypen hervorruft, die zudem durch Transposoninsertionen in die bpiB-Gene wieder aufgehoben werden konnten. So wurde vor allen Dingen eine signifikante Inhibition der Biofilmbildung bis hin zum vollständigen Verlust der Fähigkeit Biofilme zu bilden beobachtet. Ebenso wurde gezeigt, dass die Pyocyaninproduktion und auch die Motilität durch die Expression der BpiB-Proteine beeinträchtigt wurden. Durch die Zugabe von 3-Oxo-C12-HSL konnte der Schwärmphänotyp bei allen in dieser Arbeit getesteten Proteinen teilweise wiederhergestellt werden, ebenso exemplarisch die Pyocyaninbildung bei den P. aeruginosa-Klonen, die die bpiB-Gene bpiB01, bpiB04 und bpiB07 trugen. Diese Komplementationen lassen den Schluss zu, dass die bpiB-Gene mit den QS-Systemen von P. aeruginosa interagieren und vermutlich z. T. die Autoinducer vermittelte Signalweiterleitung durch deren Spaltung inhibieren, was durch die Erkenntnisse der HPLC-MS-Analyse für die Proteine BpiB01, BpiB04, BpiB05, BpiB06 und BpiB09 untermauert werden konnte. Durch die HPLC-MS Analysen konnte die Spaltung des Lactonringes für die AHL-Moleküle 3-Oxo-C8-HSL und C12- HSL für alle BpiB-Proteine nachgewiesen werden.

Kurzfassung auf Englisch: Bacterial cell communication (quorum sensing) is mainly involved in biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa. Due to its central function in biofilm formation, quorum sensing provides the possibility to develop new strategies for biofilm prevention.
In this work, nine new quorum sensing inhibiting enzymes from not cultivated microorganisms using metagenomics were isolated, biomolecularly characterized and analyzed for their biofim inhibiting effects. For four of these clones, the resonsible quorum quenching genes could be isolated and the corresponding proteins BpiB01, BpiB04, BpiB05, BpiB09 could be heterologous overexpressed. Biochemical characterization of these proteis using HPLC-MS analytics showed, that the quorum quenching activity for AHL molecules is based on cleavaeage of the lactone ring. It could be shown, that , BpiB04, BpiB05, and BpiB09 are four completely new lactonases with no similarities to any described lactonases which can cleave AHL molecules with different chemical structures.
In contrast to BpiB01, BpiB04, and BpiB09 which need zinc as cofactor (like all AHL lactonases described before), BpiB05 needs calcium. This property has been described before only for human POBs, which show lactonase activity, too.
Further analyses in P. aeruginosa showed, that the expression of the bpi genes induces several QS dependent phenotypes. These phenotypes can be neutralzed by transposon insertion into the bpi genes. Significantly inhibition of biofilm formation up to completely loss of biofil formation could be observed. In addition, pyocyanin production and motility were inhibited by Bpi protein expression. Addition of 3-oxo-C12-HSL could partially reconstitute swarming phenotypes for all tested Bpi proteins and exemplarily pyocyanin production for the bpiB genes bpiB01, bpiB04 and bpiB07. Due to these complemetations it can be presumed, that the bpi genes are able to interact with the QS systems of P. aeruginosa and inhibit the autoinducer based signal transduction by cleaving the autoinducer molecules. This presumption could be confirmed by HPLC-MS analysis for BpiB01, BpiB04, BpiB05, BpiB06 and BpiB09. Using HPLC-MS analysis, lactone ring cleaveage for the AHL molecules 3-oxo-C8-HSL and C12- HSL could be shown for all BpiB proteins.

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