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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-42203
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4220/


Poly(ethylene glycol)-conjugated Alkylamines as Novel Blocking Reagents for Immunoassays

Fujimoto, Naho

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SWD-Schlagwörter: Polyethylenglykole , Enzyme-linked immunosorbent assay , Immunoassay , Absättigung , Sensitivität , Spezifität
Freie Schlagwörter (Deutsch): Blockierungsreagenz
Freie Schlagwörter (Englisch): Blocking reagent
Basisklassifikation: 35.52 , 35.6
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 24.07.2009
Kurzfassung auf Englisch: Blocking reagents represent an essential albeit not widely studied part of solid phase
supported immunoassays. The development of novel blocking reagents was the main purpose
of this thesis. In this regard, poly(ethylene glycol)-conjugated alkyl amines, which are typical
surfactants with up to now mainly industrial applications, were studied as candidates for novel
blocking reagents in immunoassays for the first time. First, a variety of poly(ethylene glycol)-
conjugated alkyl amines was synthesised. Second, the blocking performance of the
synthesised surfactants was investigated in assay experiments.
A modular synthesis was designed that permitted the efficient preparation of poly(ethylene
glycol)-conjugated alkyl amines of different structures. Notably, one or two poly(ethylene
glycol)-groups could be linked to one or two alkyl chains, both of variable length, via a short
and simple bridge. Moreover, one or two amine groups could be inserted between the bridge
and the poly(ethylene glycol)-group and/or terminally appended on the hydrophobic side. The
synthesised substances were successfully characterised, which included the determination of
the solubility and the critical micelle concentration.
The synthesised surfactants were subjected to a number of different assay experiments.
Preliminary assays showed that cationic surfactants perform best under standard assay
conditions such as neutral pH value and physiological ion concentrations. In three distinct
ELISA formats the blocking performance of the synthesised surfactants was compared to that
of commercially available blocking reagents. It was found that no single commercially
available blocking reagent was able to achieve both good specificity and sensitivity. On the
other hand, many of the PEG-conjugated alkylamines were able to combine acceptable
specificity and sensitivity and some yielded very good results in both respects in all assay
experiments.
In conclusion, the best synthesised surfactants outperform the blocking reagents that are
commercially available to date. In addition, they do not exhibit any of the drawbacks of
proteinaceous blocking reagents, such as cross-reactivity, heterogeneity and lot-to-lot
variability. Since these novel blocking reagents achieved very promising results, a
commercialisation is hoped for in the near future. Though further research is obviously
needed, industrial preparation of the compounds should be feasible and enable a cost-efficient
production.
Kurzfassung auf Deutsch: Blockierungsreagenzien stellen zwar eine unentbehrliche Komponente eines
Festphasenassays dar, sind dafür jedoch vergleichsweise schlecht erforscht. Die Entwicklung
neuer Blockierungsreagenzien war daher das zentrale Anliegen dieser Arbeit. Daher wurden
Poly(ethylenglycol)-konjugierte Alkylamine, eine Klasse von Tensiden, die bislang
hauptsächlich in der Industrie Verwendung findet, erstmals bezüglich ihrer Eignung als
Blockingreagenzien für Immunoassays studiert. Im ersten Schritt wurde eine Reihe von
Poly(ethylenglycol)-konjugierten Alkylaminen dargestellt, und im zweiten Schritt wurden die
synthetisierten Tenside mit Hilfe von Festphasenassays auf ihre Blockierungseigenschaften
untersucht.
Es wurde eine modulare Baukasten-Synthese entworfen, mit Hilfe deren Poly(ethylenglycol)-
konjugierte Alkylamine verschiedenster Struktur effizient dargestellt werden konnten. Diese
Synthese ermöglichte die Herstellung von Tensiden mit jeweils einer oder zwei
Poly(ethylenglycol)-Gruppe(n) und Alkylkette(n) unterschiedlicher Länge, die über eine
kurze Brücke miteinander verbunden sind. Die Synthesestrategie erlaubte weiterhin den
Einbau von einer oder zwei Aminogruppe(n) zwischen der Poly(ethylenglycol)-Gruppe und
der Brücke und/oder am Ende der Alkylkette. Die synthetisierten Substanzen wurden
erfolgreich charakterisiert, dabei wurden unter anderem Löslichkeit und kritische mizellare
Konzentration bestimmt.
Die synthetisierten kationischen Tenside wurden mit Hilfe unterschiedlicher Festphasenassays
untersucht. In einer Reihe von Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass kationische Tenside
optimal unter üblichen Assaybedingungen, wie z.B. neutralem pH-Wert oder physiologischen
Ionenkonzentrationen, arbeiten. Drei unterschiedliche ELISA-Formate wurden angewandt,
um die Blockierungseigenschaften der kationischen Tenside mit denen kommerziell
erhältlicher Blockierungsreagenzien zu vergleichen. Dabei stellte sich heraus, dass keines der
kommerziell erhältlichen Reagenzien sowohl gute Spezifität als auch gute Sensitivität bieten
konnte. Hingegen waren viele der synthetisierten Reagenzien in der Lage, angemessene
Blockierungseigenschaften sowohl in Hinsicht der Sensitivität als auch der Spezifität zu
gewährleisten. Einige der kationischen Tenside konnten in dieser Hinsicht sehr gute
Ergebnisse in allen drei ELISA-Formaten erzielen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die besten Vertreter der synthetisierten Tenside
kommerziell erhältliche Blockierungsreagenzien in ihren Blockierungsfähigkeiten übertreffen.
Synthetische Blockierungsreagenzien auf Basis Poly(ethylenglycol)-konjugierter Alkylamine
schließen des Weiteren viele Nachteile aus, die bei proteinhaltigen Blockierungsreagenzien
auftreten, wie z.B. Kreuzreaktivität, Heterogenität, Verderblichkeit, Chargenunterschiede, etc.
Die vielversprechenden Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine baldige Kommerzialisierung der
neuartigen Blockierungsreagenzien erhoffen. Auch wenn weitergehende Untersuchungen
sicherlich nötig sind, sollte eine industrielle Produktion der kationischen Tenside
kostengünstig möglich sein.

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