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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-42683
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4268/


Die posttranslationale Modifikation des IL-2-Rezeptors durch ADP-Ribose

Hann, Alexander

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Basisklassifikation: 44.45
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 25.08.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Die ADP-Ribosylierung ist eine reversible, kovalente Modifikation von Proteinen, bei der ADP-Ribose von NAD auf Aminosäure-Seitenketten in Zielproteinen übertragen wird. Zu den Arginin-spezifischen Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) gehören bakterielle Toxine wie Choleratoxin und Salmonella enterica SpvB Toxin sowie membranständige Ektoenzyme von Säugetieren. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifikation von Zielproteinen auf der ART2-exprimierenden Zelllinie YAC-1 und der anschließenden Charakterisierung des neu beschriebenen ART-Zielproteins CD25.
Im ersten Teil der Arbeit wurden ART-Zielproteine in der murinen YAC-1 Lymphomzelllinie mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen identifiziert. Die alpha-Untereinheit des Interleukin-2-Rezeptors (CD25) sowie das Adhäsionsprotein CD229 wurden mittels radioaktivem ADP-Ribosylierungs-Assay als Hauptziele dieser posttranslationalen Modifikation in dieser Zelllinie bestätigt. CD25 stellt in diesen Zellen dabei das Zielprotein dar, das am meisten Radioaktivität inkorporiert. Es konnte gezeigt werden, dass CD25 ebenfalls auf der Oberfläche von primären murinen CD4+ T-Zellen ADP-ribosyliert wird. Diese CD4+/CD25+ Zellen (so genannte natürliche regulatorische T-Zellen, Tregs) machen in der Maus nur einen kleinen Prozentsatz der CD4+ T-Zellen aus.
Nach stabiler Transfektion von humaner ART1 bzw. muriner ART2.2 in die Interleukin-2 (IL-2)-abhängige humane Kit 225 sowie die murine CTLL-2 Zelllinien gelang im zweiten Teil der Arbeit der Nachweis, dass sowohl die murine als auch die humane Form von CD25 auf diesen Zellen prominente Zielproteine der ADP-Ribosylierung darstellen. Mit diesen stabil-transfizierten Zellen wurde zudem ein Zellkulturmodell etabliert zur Untersuchung der Frage, ob die ADP-Ribosylierung einen Einfluss auf die IL-2-abhängige Signaltransduktionskaskade ausübt. Es konnte in der Tat gezeigt werden, dass die ADP-Ribosylierung von Zelloberflächenproteinen auf CTLL-2 Zellen die IL-2-abhängige Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors STAT5 hemmt.
Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Identifikation der ADP-Ribosylierungsstelle(n) in der extrazellulären Domäne von murinem und humanem CD25. In silico-Analysen zeigen, dass sechs Arginine bei CD25 aus Maus, Mensch und Ratte konserviert, sowie je fünf weitere bei Maus und Mensch nicht konserviert sind. Die 3D-Kristallstruktur der humanen und das mit Hilfe dessen angefertigte 3D-Strukturmodell der murinen CD25 zeigen, dass alle konservierten Arginine an der Moleküloberfläche liegen und damit ART1 bzw. ART2.2 prinzipiell zugänglich sind. Die Ergebnisse von ADP-Ribosylierungs-Assays nach Kotransfektionen von ART2.2 und murinem bzw. humanem CD25 in humane HEK-T Zellen zeigen, dass humanes CD25 in diesen Zellen wesentlich stärker als die murine Form ADP-ribosyliert wird. Die Beobachtung, dass sämtliche zielgerichtete Arginin-Einzelmutanten von CD25 nach Ko-transfektion mit ART in HEK-T Zellen noch radio-ADP-ribosyliert werden, legt nahe, dass CD25 an mehr als einem Arigninrest ADP-ribosyliert wird.
Die Ergebnisse der Arbeit weisen neue potentielle ART-Zielproteine auf und geben Hinweise auf eine mögliche funktionelle Rolle der posttranslationalen Modifikation der Interleukin-2-Rezeptor alpha-Untereinheit (CD25) mit ADP-Ribose.
Kurzfassung auf Englisch: ADP-ribosylation is a reversible covalent protein modification in which ADP-ribose is transferred from NAD to side chains of target proteins. Members of the group of arginine specific mono-ADP-ribosyltransferases (ARTs) are bacterial toxins like Cholera toxin and Salmonella enterica SpvB toxin as well as endogenous mammalian membrane bound ecto enzymes. The present study focuses on the identification of target proteins on the ART2-expressing lymphoma cell line YAC-1 and the subsequent analysis of the newly identified ART target protein CD25.
In the first part of the study (etheno)-ADP-ribosylated proteins on the YAC-1 lymphoma cell line were isolated and identified by mass spectrometry. The alpha subunit of the interleukin-2 receptor (CD25) as well as the adhesion molecule CD229 were confirmed as main targets of the ADP-ribosylation on YAC-1 cells by radioactive ADP-ribosylation assays. On these cells, CD25 incorporates more radioactivity than any other target protein. Additional results show that CD25 can be ADP-ribosylated on the cell surface of murine CD4+ T lymphocytes. These CD4+/CD25+ cells (called regulatory T cells, Tregs) represent a small group of the CD4+ T cell population.
In the second part of the study, stable transfection of human ART1 or murine ART2.2 in the interleukin 2 dependent human cell line Kit 225 and murine cell line CTLL-2 led to the confirmation of CD25 as a prominent ADP-robosylation target in these cells as well. The ART2.2-transfected interleukin 2 dependent cell line CTLL-2 provided a new model for measuring the effect of cell surface ADP-ribosylation on signal transduction via the interleukin 2 receptor. Indeed, the results of this study indicate that ADP-ribosylation of cell surface proteins inhibits the interleukin 2-induced phosphorylation of STAT5.
The third part of the study concerns the identification of the ADP-ribosylation site(s) in the extracellular domains of human and murine CD25. In silico analyses revealed six conserved arginine residues in human, mouse and rat CD25, as well as additional five nonconserved arginines each, in human and mouse CD25. The 3D-structure of human CD25 and a subsequent computer generated 3D-model of murine CD25 reveal that all conserved arginines are exposed on the protein surface and, therefore, present potential ADP-ribosylation sites. The results of radio-ADP-ribosylation assays with human HEK-T cells transiently co-transfected with ART2.2 and human or murine CD25 indicate that the human form is a much better ADP-ribosylation target in these cells than its murine counterpart. Site-directed mutagenesis of each arginine in murine CD25 and each conserved arginine in human CD25 to lysine and subsequent radioactive ADP-ribosylation assays in ART-co-transfected HEK cells provided evidence that CD25 is ADP-ribosylated on multiple sites.
Taken together, the results of this study identify new potential ART-target proteins and indicate possible functional consequences of the posttranslational modification of CD25 by ADP-ribose.

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