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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-42859
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4285/


Untersuchung von hydrophoben Protein-Ligand-Wechselwirkungen in wässriger Lösung mittels Saturation Transfer Difference NMR am Beispiel der Enzymreaktion der (+)-Germacren D Synthase

Investigation of hydrophobic protein ligand interactions in aqueous solution using saturation transfer difference NMR using the example of the (+)-germacrene D synthase enzyme reaction

Hackl, Thomas

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SWD-Schlagwörter: NMR-Spektroskopie , Enzym , Enzymkinetik , Terpene , Micelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): Protein-Ligand-Interaktion , Hydrophob , STD NMR , SPR
Freie Schlagwörter (Englisch): protein ligand interaction , hydrophobic , STD NMR , SPR
Basisklassifikation: 35.69
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 11.09.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Es gibt eine Vielzahl von Beispielen, bei denen hydrophobe Wechselwirkungen in Bezug auf molekulare Erkennungsprozesse in biologischen Systemen eine wichtige Rolle spielen. Das STD-NMR-Verfahren hat sich zu einer wichtigen Methode entwickelt, mit der Bindungsvorgänge in Protein-Ligand-Systemen untersucht und charakterisiert werden können. Eines der Probleme, welches bei dem Umgang mit hydrophoben (oder amphiphilen) Verbindungen in wässriger Lösung auftritt, besteht in der spontanen Selbstassoziation (Aggregation) der hydrophoben oder amphiphilen Monomere zu großen Molekülverbänden. Das Messprinzip des STD-Experiments beruht auf der selektiven Sättigung eines Proteins, die aufgrund der Unterschiede in den T2 Relaxationszeiten zu kleinen organischen Molekülen möglich ist. Die Aggregation kleiner Moleküle stellt wiederum eine weitere Quelle für Strukturen mit großem Molekulargewicht dar. Die (+)-Germacren D Synthase wurde als ein Modellsystem gewählt, um die Bindung hydrophober Liganden anhand von STD-Experimenten zu untersuchen. Neben dem natürlichen Enzymsubstrat, Farnesyldiphosphat, wurde Farnesylmonophosphat als ein Substratanalogon für die Untersuchungen ausgewählt. Mithilfe der STD-NMR-Methode konnte sowohl das Aggregationsverhalten der Liganden als auch die Bindungseigenschaften zu dem Enzym charakterisiert werden. Im Laufe der Untersuchungen zeigte sich ein wesentlicher Einfluss von Magnesiumionen, welche von dem Enzym als Cofaktor bei der Bindung der Diphosphatgruppe benötigt werden, sowohl auf die Bindungseigenschaften als auch auf die Bildungskonstante von Micellen. Bereits geringe Mengen an MgCl2 im Messpuffer erniedrigten die CMC der Farnesylphosphate deutlich. Die Voruntersuchungen bezüglich des Aggregationsverhaltens und deren Auswirkungen auf das STD-Experiment waren für die Auswertung der Titrationsreihen essentiell. Zusätzlich wurde die SPR-Methode (surface plasmon resonance) angewandt um die STD-Ergebnisse zu überprüfen und abzusichern. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde eine neue Variante des STD-Experiments eingeführt, mit der sich Enzymreaktionen charakterisieren lassen. Die Variante besteht in der sequentiellen Akquisition von vielen STD-Spektren in nur einem Experiment. Wenn das Verhältnis k 1/kcat groß ist, kann der STD-Effekt beobachtet und das Bindungsepitop für das Substrat charakterisiert werden. Die off-resonance Spektren jedes STD-Experiments lassen sich für die Reaktionsverfolgung verwenden, so dass der Substrat-Zeit-Verlauf (Progresskurve) aufgezeichnet werden kann. Mit Hilfe Lambert W Funktion können durch Analyse der Progresskurven kinetische Daten erhalten werden.
Kurzfassung auf Englisch: Hydrophobic interactions play a crucial role in many molecular recognition processes in biological systems. STD NMR has become an important tool for the characterization of protein-ligand binding processes. A problem in analyzing hydrophobic (or amphiphilic) ligands in aqueous solution is their spontaneous self association (aggregation) to larger molecular assemblies. STD experiment relies in the selective saturation of protein resonances. This is possible due to the differences in the T2 relaxation time of proteins compared to small organic compounds. Self aggregation of small molecules on the other hand yields another structure of large molecular weight. (+)-Germacrene D synthase was chosen as a model system to investigate in the STD experiment the binding of hydrophobic ligands. In addition to the natural substrate of the enzyme, farnesyl diphosphate, farnesyl monophosphate has been chosen as a substrate analogue for these investigations. Applying the STD NMR technique it was possible to characterize the aggregation behavior of the ligands as well as the binding properties to the enzyme. During the investigations a strong influence of magnesium ions on the binding constants and formation of micelles was observed. Magnesium serves as a cofactor for the coordination of the diphosphate group in the enzyme. Already small amounts of MgCl2 in the buffer solutions strongly reduced the CMC of the farnesyl phosphates. STD NMR titration experiments could not have been interpreted without an exact knowledge of the ligands solution behavior and their effect on the individual STD experiment. In order to validate the results from STD NMR measurements, for both compounds binding to the enzyme was also characterized by means of SPR (surface plasmon resonance). In the course of this work a new version of the STD experiment that enables characterization of enzyme reactions has been presented. This version consists in a sequential acquisition of many STD spectra in one experiment. If k 1/kcat is high STD NMR effects can be observed and the binding epitope of the substrate can be determined. The off resonance spectra of each STD experiment can be used to track the reaction and the time course of loss of substrate can be plotted as a progress curve. Parameters of the enzyme kinetic can be calculated from the progress curve based on the Lambert W function.

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