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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-42945
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4294/


Untersuchungen zur Struktur eines Amplikons im Intron 1 des humanen epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors: Erstmutation in der Mammakarzinom-Entstehung

Structural characterization of an amplicon within the first intron of the human epidermal growth factor receptor: Primary mutation in the development of breast cancer

Meyer-Staeckling, Sönke

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SWD-Schlagwörter: Brustkrebs , Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , Genmutation , Genamplifikation
Basisklassifikation: 44.48
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Brandt, Burkhardt (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 01.09.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Der Fokus dieser Arbeit war die Untersuchung der Genamplifikation von EGFR im Bereich von Chromosom 7p11-14. Anhand des Modells der Mammakarzinom Zelllinie MDA-MB-468 sowie der Linien A431 und BT-20, die eine erhöhte durchschnittliche Genkopienzahl („Average Gene Copy Number“ – AGCN) für EGFR besitzen, sollten durch molekulargenetische Techniken Rückschlüsse auf mögliche Mechanismen der Entstehung der Genamplifikation gezogen werden. Die Analyse von Veränderungen der AGCN wurde basierend auf Fine Tiling Array-CGH („Competitive Genomic Hybridisation“) und quantitativer Real-Time PCR (qPCR) durchgeführt. Durch permanente EGF-Stimulation wurden MDA-MB-468 Sublinien mit absteigender AGCN für das EGFR-Gen generiert (MDA(+) 2-3; MDA0107 3-7; MDA0106 14-17). An ihnen konnte der Zusammenhang zwischen Genkopienzunahme und Zunahme der mRNA Expressionshöhe bestätigt werden (69).

Aus diesen Untersuchungen der EGFR-Amplikons von MDA-MB-468 (MDA-WT), drei seiner Sublinien mit unterschiedlicher AGCN für EGFR sowie A431 und BT-20 ergaben sich distinkte amplifizierte Bereiche der chromosomalen DNA. Diese schlossen, mit Ausnahme der MDA-MB-468 Sublinie mit nahezu diploider EGFR-Kopienzahl (MDA(+)), jeweils das EGFR-Gen in voller Länge ein. Das Amplikon der Sublinie MDA(+) zeigte nach den Exonen 4 bis 7 keine erhöhte AGCN für EGFR. Es wurden Regionen mit evolutionär-bedingter, erhöhter chromosomaler Instabilität an den Start- und Endregionen der Amplikons lokalisiert (177). Für die MDA-MB-468 Sublinie konnte ein mehrstufiges Amplifikationsmuster beschrieben werden, wobei die Länge des Amplikons mit steigender AGCN für EGFR zunahm. Dabei bildete das Amplikon der Sublinie MDA(+) das zentrale Element des Hauptamplikons aus. Dem Hauptamplikon wurden zwei weitere Regionen telomer- und centromerwärts des zentralen Elementes zugeordnet. Diese Regionen zeigten ab dem Amplikon der Sublinie MDA0107 DNA-Zugewinne. Eine gering amplifizierte Region schloss sich centromerwärts dem Hauptamplikon von dem Subklon MDA0106 und MDA-WT an. In der telomerwärtigen Startregion des Amplikons wurden im Bereich eines retroviralen HERVK-Elements (179,180) durch qPCR Kopienzahlen bestimmt, die – bezogen auf die AGCN von EGFR – um Faktor 2-16 erhöht waren. In einem 4,8kb telomerwärts der HERVK-Sequenz lokalisierten retroviralen SVA_A-Element konnten durch Long-Range PCR differentielle PCR-Fragmente amplifiziert werden, die auf chromosomale Umlagerungen in einem Sequenzbereich hindeuten, der eine Akkumulation repetitiver DNA Motive aufweist. Die Analyse der telomerwärtigen Startregion des Amplikons durch qPCR zeigte in der SVA_A-Sequenz die ersten chromosomalen Bereiche mit erhöhter DNA-Kopienzahl. Ferner wurden durch vergleichende Softwareanalysen Homologien zwischen der repetitiven SVA_A-Sequenz und dem HERVK-Element von >500 Basen nachgewiesen.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse deutlich, dass alle analysierten EGFR-Amplikons innerhalb der rare fragile site (RFS) FRA7A lokalisiert sind. Es wäre demnach möglich, dass die Aktivierung der RFS durch Einzel- oder Doppelstrangbrüche erfolgen könnte (186, 187), die wiederum durch die Anwesenheit stark repetitiver Sequenzelemente begünstigt werden. Solche repetitiven Sequenzen führen häufig durch Leseungenauigkeiten zur Abnahme der Replikationsgeschwindigkeit an der Replikationsgabel. Aus einer möglichen Aktivierung der RFS FRA7A entstehende Fehler bei der NAHR (Nicht allelische homologe Rekombination) oder NHEJ („Non homologous end joining“) könnten als Auslöser des BFB-Mechanismus angesehen werden (89). Dieser wiederum könnte Ausgangspunkt für die beobachteten Amplifikationen mit EGFR im Zentrum sein.

Um die genomische Charakterisierung des EGFR-Status auf Einzelzell-Ebene zu ermöglichen, wurde eine Methode etabliert, die basierend auf Mikromanipulation mit anschließender „Whole Genome Amplification“ (WGA) das gesamte Genom der Zelle amplifiziert (155,156). An der durch WGA amplifizierten DNA wurden anschließend die Folgeapplikationen der Mikrosatelliten-PCR zur Detektion von allelischen Imbalancen (AIs), der Sequenzierung zur Überprüfung der Basensequenz, sowie Verfahren zur Analyse von Änderungen in der DNA-Kopienzahl, die qPCR und „Fine Tiling Array CGH“ validiert. Auf der Basis dieser Methode wurde die Heterogenität der MDA-MB-468 Zellen für den EGFR-Lokus in Einzelzellen quantitativ nachgewiesen.

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