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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-42955
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4295/


Impact of single strand annealing on double strand break repair and chromosomal stability in mammalian cells: A component of the repair network

Bedeutung der Single-Strand-Annealing am Doppelstrang Brüche Reparatur und chromosomale Stabilität in Säugerzellen: Eine Komponente von der Reparatur-Netzwerk

Mansour, Wael Yassin

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SWD-Schlagwörter: DNA double strand break repair
Freie Schlagwörter (Englisch): DNA double strand break repair
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 28.09.2009
Kurzfassung auf Englisch: Mammalian cells have evolved powerful network of double strand break (DSB) repair pathways to encounter the deleterious effect of these lesions. These repair pathways are nonhomologous end joining (NHEJ), gene conversion (GC) and single strand annealing (SSA). The repair pathways are mechanistically distinct and differ in the fidelity of the repair. Whereas GC mostly ensures accurate repair, neither NHEJ nor SSA does. The misrepair of DSBs by these repair pathways may induce many types of genetic alterations with consequences such as cell death or cancer. In mammalian cells, these pathways are regulated by a complex signalling, which determines whether a DSB is repaired or misrepaired.
The main aim of this Ph.D. is to understand the regulation of the aforementioned repair pathways. Three main questions were addressed: (1) How can these pathways be regulated to avoid any misrepair? (2) Is there any hierarchy between these repair pathways? (3) Can one pathway be replaced by another?
The most appropriate strategy to address this aim is to assess these repair pathways in relation to each other using specific repair constructs. In this Ph.D., for each repair pathway a specific repair construct was used. In addition, for the first time a new repair construct was developed in order to detect the relation between NHEJ and SSA. These experiments were performed in wild-type cells (CHOK1) and their NHEJ-deficient derivatives (xrs5) that have defect in Ku80 gene.

The following points have been reported:
• The use of both GC and SSA was increased 6- and 8-fold in xrs5 cells, suggesting that NHEJ is dominant over the other two repair pathways. However, xrs5 cells still repair DSBs by an efficient but slower endjoining pathway compared to their wild type CHOK1 cells. This alternative pathway is non-conservative that leads to increasing deletion length and it is PARP1-dependent. This indicates that Ku-protein may regulate the genomic integrity in mammalian cells by controlling; on the one hand repair fidelity of NHEJ via protecting the DSB ends against nucleolytic activity. On the other hand, Ku-protein suppresses the non-conservative PARP1-dependent endjoining as well as both GC and SSA.

• NHEJ was not affected, if GC is impaired by Rad51-knockdown. Interestingly, when SSA was available, Rad51-knockdown promotes SSA frequency at the expense of NHEJ efficiency. This implies that Rad51 may indirectly promote NHEJ by limiting SSA.

• The data presented here propose a model for a functional hierarchy for DSB repair network in mammalian cells. According to this hierarchy, NHEJ dominates and suppresses the other two repair pathways. GC also dominates over and suppresses the most deleterious SSA repair pathway. If one of central repair proteins is missing or the damage signalling is disturbed, these repair pathways crosstalk with each other in order to maintain the survival even at the expense of repair fidelity. As the DNA damage signalling is impaired in most of tumours, assessing the crosstalk and the hierarchy between repair pathways in tumour cells would be of most important in the future. Preliminary results in our laboratory have revealed a switch to misrepairing of the DSBs in tumour cells. This switch may enable the tumour cells not only to survive but also to accumulate genetic alterations.
Kurzfassung auf Deutsch: Hinsichtlich der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) verfügen Säugerzellen über ein sehr effizientes Netzwerk, um einer Schädigung durch diese Schäden entgegen wirken zu können. Zu diesen Reparaturwegen zählt die nicht homologe Endverknüpfung (NHEJ), die Genkonversion (GC) sowie das ‚Single-Strand-Annealing’ (SSA). Diese Reparaturwege unterscheiden sich nicht nur in ihren einzelnen Schritten sondern auch in der Genauigkeit. GC beinhaltet in der Regel eine fehlerfreie Reparatur nicht aber NHEJ und SSA. Eine Falschreparatur der DSB durch diese Reparaturwege kann viele genetischen Veränderungen zur Folge haben, was u.a. zur Inaktivierung oder kanzerogenen Transformation der Zelle führen kann. In Säugerzellen sind diese Wege durch eine komplexe Signalgebung reguliert, wodurch letztendlich entschieden wird, ob ein DSB korrekt oder nicht korrekt repariert wird.
Das Hauptziel dieser Ph.D. war es, die Regulierung dieser Reparaturwege zu verstehen. Drei zentrale Fragen wurden gestellt: (1) Wie müssen diese Wege geregelt werden, um eine Falschreparatur zu verhindern? (2) Besteht für die DSB-Reparaturwege eine Hierarchie? (3) Kann ein Reparaturweg durch einen anderen ersetzt werden?
Die beste Strategie, um eine Regulation der DSB-Reparaturwege zu erforschen, ist die Verwendung von speziellen Reparaturkonstrukte. In dieser Arbeit wurde dabei für jeden Reparaturweg ein spezifisches Reparaturkonstrukt verwendet. Um insbesondere die Regelung zwischen NHEJ und SSA zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit erstmalig ein Konstrukt entwickelt, welches es ermöglicht, beide Reparaturwege zu detektieren. Durchgeführt wurden die Experimente sowohl mit den Wildtyp-Zellen (CHOK1) als auch der Tochterlinie Xxrs5, welche aufgrund eines Defektes im Ku80 Gen im NHEJ defizient ist.

Folgende zentrale Ergebnisse wurden erlangt:
• In den NHEJ-defizienten Zellen (xrs5) nimmt die Zahl der DSB, die mittels GC bzw. SSA repariert werden, um das 6- bzw. 8-fache zu. Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass NHEJ normalerweise der dominante Reparaturweg ist. Allerdings können die NHEJ-defizienten DSB immer noch sehr effizient reparieren, wenn auch im Vergleich zu den Wildtypzellen mit langsamerer Kinetik. Dieser alternative Weg hängt von PARP1 ab und ist nicht konservativ, sondern führt zu einer Vielzahl an Deletionen. Diese Daten deuten an, dass in Säugerzellen das Ku-Protein die genomische Integrität kontrolliert, indem es auf der einen Seite über das NHEJ eine in der Regel fehlerfreie Reparatur garantiert (möglicherweise durch Unterdrückung nucleolytischer Aktiviät an den DSB-Enden) und auf der anderen Seite sowohl GC und SSA als auch die nicht-konservative PARP1-abhängige Reparatur unterdrückt.
• Es wurde gefunden, dass NHEJ nicht davon beeinflusst wird, wenn GC durch Rad51-Knockdown unterdrückt wird. Ist allerdings SSA verfügbar, so bewirkt ein Rad51-Knockdown, dass weniger NHEJ durchgeführt wird und dafür mehr SSA. Dies deutet an, dass Rad51 indirekt NHEJ fördern kann, in dem es SSA niedrig hält.
• Basierend auf den Daten dieser Arbeit, kann für Säugetierzellen ein Modell für eine funktionale Hierarchie des DSB-Reparaturnetzwerkes aufgestellt werden. Gemäß dieser Hierarchie, ist NHEJ dominant und unterdrückt die anderen beiden Reparaturwege. Anderseits unterdrückt GC das sehr fehlerhafte SSA. Wenn ein zentrales Reparaturproteine fehlt oder die Schadensignalisierung gestört ist, können die Zellen aufgrund dieser Regulierung weiterhin die DSB sehr effizient reparieren, wenn auch mit Verlust in der Genauigkeit. Da in vielen Tumoren die DNA-Schadensignalisierung gestört ist, könnte die Regulierung der DSB-Reparaturwege und deren Hierarchie gerade für die Tumorzellen von besonderer Bedeutung sein. Erste Ergebnisse in unserem Labor haben ergeben, dass in Tumorzellen die Falschreparatur von DSB häufiger ist. Diese Veränderung könnte zur Konsequenz haben, dass Tumorzellen zwar besser überleben aber auch mehr genetische Veränderungen akkumulieren.

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