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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43039
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4303/


Untersuchungen zum Druckwechselverfahren als schonende Methode zur Entkeimung flüssiger Arzneistoffzubereitungen

Pressure change technology as a gentle cold sterilisation procedure for drug solutions

Hanusa, Enrico

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SWD-Schlagwörter: Sterilisation , Stabilität , Verdichtetes Gas , Kraftmikroskopie , Insulin
Freie Schlagwörter (Deutsch): Druckwechseltechnologie , Mikroorganismen , Zellruptur
Freie Schlagwörter (Englisch): pressure change treatment , microorganisms , cell rupture
Basisklassifikation: 30.30
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Leopold, Claudia Sabine (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 05.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Die Entkeimung pharmazeutischer Zubereitungen erfolgt häufig durch thermische Verfahren. Diese sind aufgrund einer kontinuierlichen apparativen Weiterentwicklung in den vergangenen Jahrzehnten in der Anwendung sehr sicher geworden und die thermische Belastung des zu entkeimenden Gutes konnte auf ein Minimum reduziert werden. Dennoch sind viele Wirkstoffe aufgrund ihrer geringen thermischen Stabilität diesen Verfahren nicht zugänglich. Daher gab es in der Vergangenheit verschiedene Bemühungen, alternative, nicht-thermische Verfahren mit vergleichbarer Sicherheit zu entwickeln. Mit der vorliegenden Arbeit zum Druckwechselverfahren soll ein Beitrag zu diesem Entwicklungsprozess geleistet werden. In Vorversuchen wurden zunächst verschiedene Eigenschaften der beispielhaft ausgewählten Mikroorganismen bestimmt. Neben Form und Größe der Zellen zur Berechnung der Zelloberfläche und des Zellvolumens wurden deren mechanische Eigenschaften mittels AFM-Messungen und die thermischen Eigenschaften anhand von DSC-Untersuchungen charakterisiert. Insgesamt wurden neun verschiedene Spezies betrachtet. Zur Größenbestimmung der Mikroorganismenzellen kam neben den üblichen mikroskopischen Verfahren auch die Laserdiffraktometrie zum Einsatz. Für die Druckwechselversuche kamen zwei verschiedene Hochdruckautoklaven zum Einsatz. Als Prozessgase wurden Stickstoff, Distickstoffoxid sowie Mischungen aus beiden Gasen verwendet. REM-Untersuchungen an druckwechselbehandelten Mikroorganismen und die optische Dichte der Proben bestätigten den angenommenen Zerstörungsmechanismus; die spontane Entspannung der mit Gas beladenen Keimsuspensionen führt infolge des Ausgasens zu einem Zerplatzen der Zellen. Die Quantifizierung der Keimzahlreduktion erfolgte mit dem Spatelplattenverfahren. Parallel dazu wurde mittels Live/Dead-Färbung der Anteil toter, nicht zerstörter Zellen bestimmt. Zusätzliche toxische Effekte waren besonders bei Distickstoffoxid zu beobachten und ursächlich für dessen hohe Effektivität. Die Verwendung von Stickstoff führte hingegen nur in wenigen Fällen zu einem erhöhten Anteil an toten, intakten Zellen. Insgesamt wurde das Absterbeverhalten von Mikroorganismen im Druckwechselverfahren an sieben Vertretern aus den Gruppen der grampositiven und gramnegativen Bakterien sowie an zwei Pilzen bei 500 bar und 25°C mit den Prozessgasen Stickstoff und Distickstoffoxid untersucht. Mit Stickstoff wurden dabei Reduktionsraten zwischen 0,03 und 2,5 Zehnerpotenzen erzielt; durch die Verwendung von Distickstoffoxid konnten die Reduktionsraten auf Werte zwischen 1,2 und 6,8 deutlich erhöht werden. Ein Einfluss des Druckes und damit verbunden der Gelöstgasmenge war im untersuchten Bereich von 200-500 bar nur bei den Stickstoff-Versuchen zu beobachten, wobei die Zunahme der Keimzahlreduktion bei einer Druckerhöhung von 400 auf 500 bar überproportional hoch war. Darüber hinaus konnte durch mehrfach aufeinander folgende Druckwechsel eine Steigerung der Gesamtreduktion erzielt werden. Trotz der angestrebten nicht-thermischen Prozessführung wurde auch der Einfluss der Temperatur auf die maximal erreichbare Reduktionsrate untersucht. Die in einem sehr engen Temperaturbereich von 10-40°C durchgeführten Versuche zeigten, dass eine von 25°C abweichende Prozesstemperatur die Effektivität des Verfahrens deutlich erhöht. So wurde mit der Absenkung der Prozesstemperatur auf 10°C eine Erhöhung der Keimzahlreduktion um bis zu 500 % erreicht. Mit einer Prozesstemperatur von 40°C in Kombination mit Distickstoffoxid als Prozessgas konnte sogar bei einer Ausgangskeimzahl von 108 KBE/ml Sterilität erzielt werden. Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen an wässrigen Lösungen von L-Epinephrin, D-Penicillamin, Physostigmin und Paraoxon belegten, dass die Entkeimung im Druckwechselautoklav hinsichtlich der Belastung des Sterilisationsgutes mit der Sterilfiltration vergleichbare Ergebnisse liefert. Als wichtigster Parameter für die Stabilität von flüssigen Arzneistoffzubereitungen konnte neben dem verwendeten Sterilisationsverfahren der pH-Wert der Lösung bestätigt werden. Der Einfluss einer Schutzgasatmosphäre war im Vergleich dazu deutlich weniger ausgeprägt. Zwischen begasten und unbegasten Proben wurden nur geringe Unterschiede gefunden. Beschleunigte Haltbarkeitstests an wässrigen L-Epinephrin-Zubereitungen zeigten, dass die Druckwechselbehandlung keinen negativen Einfluss auf die Langzeitstabilität der Arzneistoffzubereitungen ausübt. Dem in den vergangenen Jahren stark gestiegenen Anteil von Peptid-Wirkstoffen in der Pharmazie wurde mit den Stabilitätsuntersuchungen an Humaninsulin Rechnung getragen. Bei dieser Wirkstoffgruppe könnte die Druckwechseltechnologie daher einen wesentlichen Beitrag zur schonenden Entkeimung und damit zur Arzneimittelsicherheit leisten. Die druckwechselbehandelten Humaninsulin-Lösungen wurden mittels HPLC und Zirkulardichroismus analysiert.
Kurzfassung auf Englisch: The sterilization of pharmaceutical formulations often involves thermal treatment. Continuous improvement of the required technical equipment in the past decades led to safe sterilization procedures. Furthermore, optimized temperature/time regimes have reduced the thermal stress of formulations to be sterilized. Many active pharmaceutical ingredients (APIs) cannot be sterilized by heat sterilization due to their low thermal stability. The need for safe non-thermal sterilization procedures led to the development of various novel cold sterilization methods. The aim of this work was to verify the suitability of the pressure change technology as a gentle cold sterilization procedure. In preliminary experiments different properties of the chosen model microorganisms were determined. Besides form and size of the cells (for calculation of cell surface and cell volume) their elastic properties were characterised by AFM and the thermal characteristics by DSC. Microscopic methods but also laser diffraction were used to determine the size of the microorganism cells. The results of these methods did not differ significantly, so that laser diffraction is recommended as a powerful method for size determination of microorganism cells. Thermal analysis of vegetative microorganisms revealed no significant differences between the thermograms. The elastic properties of micoorganism cell wall were investigated by atomic force microscopy. For the pressure change treatment two different high pressure autoclaves were used. Nitrogen, nitrous oxide as well as mixtures of both gases were used. The mechanism of cell destruction was analysed by scanning electron microscopy and optical density. The following mechanism was confirmed: an increase in the intracellular volume and pressure by the released gas after the expansion step ultimately leads to a disruption of the cell. The sterilizing effect was evaluated by determining the number of viable cells after pressure change treatment compared to that initally added. The number of viable cells was determined by quantification of the number of colonies grown on agar medium. In addition, the Live/Dead assay was used to quantify the fraction of dead cells. Toxic effects were observed particularly with nitrous oxide as process gas supporting its efficacy, whereas microorganism cultures treated with nitrogen scarcely showed increased numbers of dead cells. Altogether, the reduction rates of nine microorganism species were analysed with nitrogen and nitrous oxide as process gas, respectively, at 500 bar and 25°C. With nitrogen reduction rates between 0.03 and 2.5 orders of magnitude were achieved. A significant increase of the reduction rates could be observed with nitrous oxide (1.2- 6.8 orders of magnitude). An influence of the applied pressure in the examined range of 200-500 bar was recognizable only with nitrogen as process gas. Especially a pressure increase from 400 to 500 bar led to a significant increase of the reduction rate. By repeating the pressure change treatment an increase of the reduction rate was achieved. All experiments were carried out within a temperature range of 10-40°C. Temperatures above or below 25°C were most effective. A decrease of the temperature to 10°C increased the reduction rate up to 5 fold. At 40°C sterility was achieved with nitrous oxide as process gas. With nitrogen a treatment time of only 5 min already led to the maximum reduction rate. Because of the toxic effect of nitrous oxide a time-dependent reduction rate up to a treatment time of 60 min was observed. Moreover, the age of the cells influenced the efficacy of the process; older cells were less sensitive. The influence of the bioburden was investigated by variation of the cell concentration.
Chemical stability was confirmed with all investigated drugs (L-Epinephrine, D-Penicillamine, Eserine and Paraoxon). The pH was the most important parameter with regard to the stability of the aqueous drug solutions. The influence of a protective gas atmosphere was comparatively low. The accelerated stability tests of different L-Epinephrine solutions showed no negative influence on their shelf-life. The increasing number of biologicals for therapeutical use was accounted for by stability testing of human insulin. Insulin formulations are usually intended for parenteral application, moreover their thermo-sensitivity prohibit heat sterilization. The pressure change technology could provide an essential contribution to the gentle sterilization of these formulations. Insulin chemical stability was confirmed by HPLC analysis. However, the results of the circular dichroism experiments revealed a partial change in the secondary and tertiary structure. However, the differently pronounced changes in the molecule structure did not allow a final conclusion.

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