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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43173
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4317/


Alterations of the ubiquitin-proteasome system in targeted cMyBP-C mice with hypertrophic cardiomyopathy

Veränderungen des Ubiquitin-Proteasom Systems in cMyBP-C knockout Mäusen

Englmann, Daniel Riccardo

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SWD-Schlagwörter: Hypertrophische Herzmuskelkrankheit , Herzmuskelkrankheit , Sarkomer , Sekundenherztod , Knockout <Molekulargenetik> , Verlauf , Ubiquitin , Proteasom
Freie Schlagwörter (Deutsch): cMyBP-C , UPS , cardiac Myosin binding Protein C
Freie Schlagwörter (Englisch): cMyBP-C , UPS , kardiales Myosin-bindendes Protein C
Basisklassifikation: 44.85
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.09.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 23.10.2009
Kurzfassung auf Englisch: Mutations in the cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C) gene are frequently involved in familial hypertrophic cardiomyopathy. The work was based on former data suggesting that the ubiquitin-proteasome system (UPS) is not only responsible for the degradation of truncated cMyBP-C, but that mutated cMyBP-C can also cause impairment of the UPS. These data had raised the hypothesis that cMyBP-C mutations have at least two consequences – the lack of enough wild-type protein (“haploinsufficiency”) and impairment of the UPS. This thesis studied whether UPS alterations also exist in a model of cardiac hypertrophy associated with a complete absence of both cMyBP-C mRNA and protein. Thus, the change in the UPS could either be due to the lack of cMyBP-C (“extreme haploinsufficiency”) or to indirect consequences of cardiac hypertrophy.
The experiments were performed in cMyBP-C-KO mice that had been created by targeted deletion of the MYBPC3 gene encoding cMyBP-C. We studied myocardial tissues of cMyBP-C-KO mice at different postnatal time points (birth to 50 wks) and compared them to age-matched wild-type (WT) mice (n=5-8 in each group). The steady state levels of ubiquitinated proteins were determined by Western-blot analyses. In both groups, the ubiquitinated protein amount dropped after birth. Compared to WT levels ubiquitinated proteins were up to 122% higher in KO mice. The chymotrypsin-like activity of the proteasome was measured with the specific SUC-LLVY-AMC fluorogenic substrate. The difference in chymotrypsin-like activity between KO and WT was 0 at birth and then increased to >50% at 6 wks.
The chymotrypsin-like activity was positively correlated with the degree of hypertrophy in KO (Spearman r=0.39, P<0.01), but not with ubiquitinated protein levels. To determine whether the higher chymotrypsin-like activity results from higher levels of the protein carrying this activity we determined the concentration of the beta-5-subunit of the 20S proteasome. The levels of beta-5-subunit dropped at a similar rate shortly after birth in both WT and KO. To investigate whether the higher UPS activity in KO is associated with increased ATP usage and therefore increased AMP-kinase activity, the concentration of phosphorylated acetyl-CoA carboxylase (pACC) was determined by Western-blot. The pACC level decreased after birth at exactly the same rate in both mouse lines. In summary, this work shows that i) the UPS is altered in KO at different postnatal time points, ii) the chymotrypsin-like activity increases with the degree of hypertrophy. These data suggest that i) UPS alterations are a common remodeling mechanism associated with cardiac hypertrophy and can occur in the absence of cMyBP-C and ii) the higher chymotrypsin-like activity is likely a compensatory mechanism against further development of hypertrophy.
Kurzfassung auf Deutsch: Mutationen im kardialen Myosin-bindenden Protein C (cMyBP-C) Gen sind ein häufiger Grund für die hypertrophe Kardiomyopathie. Die vorliegende Arbeit baut auf Veröffentlichungen auf, die zu dem Ergebnis kamen, dass das Ubiquitin Proteasom System (UPS) nicht nur für den Abbau mutierter cMyBP-C Varianten verantwortlich ist, sondern dass Letztere auch das UPS beeinträchtigen können. Demnach hätten Mutationen von cMyBP-C mindestens zwei Auswirkungen: einen Mangel an Wildtyp (WT) cMyBP-C („Haploinsuffizienz“) und eine Beeinträchtigung des UPS. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Veränderungen des UPS auch in einem Herzhypertrophiemodell ohne cMyBP-C mRNA und Protein bestehen. In diesem Fall wäre jegliche Änderung im UPS entweder als Folge des Fehlens von cMyBP-C („extreme Haploinsuffizienz“) oder als indirekte Folge einer Herzhypertrophie anzusehen.
Die Versuche wurden mit cMyBP-C-KO Mäusen durchgeführt, welche durch gezielte Deletion des MYBPC3 Gens, das für cMyBP-C kodiert, geschaffen worden waren. Herzgewebe von cMyBP-C-KO Mäusen unterschiedlichen Alters (Geburt – 50 Wochen) wurde mit Herzgewebe der zugehörigen WT Mäusen (n=5-8 pro Gruppe) gleichen Alters verglichen. Die Werte der sich im Fließgleichgewicht befindlichen ubiquitinierten Proteine wurden mit Western Blots bestimmt. In beiden Gruppen fielen die Werte der ubiquitinierten Proteine nach der Geburt ab. Im Vergleich zu den Werten bei den WT waren die ubiquitinierten Proteine in den KO Mäusen bis zu 122% höher. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität des Proteasoms wurde mit Hilfe des spezifischen fluoreszenzerzeugenden Substrates SUC-LLVY-AMC gemessen. Sie war bei KO und WT zum Zeitpunkt der Geburt gleich hoch, nahm jedoch in den darauffolgenden sechs Wochen bei KO um mehr als 50% stärker zu als bei WT. Bei den KO war die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität mit dem Ausmaß der Herzhypertrophie korreliert (Spearman r=0.39, P<0.01), die Werte der ubiquitinierten Proteine hingegen nicht. Um festzustellen, ob die höhere Chymotrypsin-ähnliche Aktivität Folge eines Anstieges des Proteins ist, welches diese Aktivität trägt, wurde die Konzentration der beta-5-Untereinheit des 20S Proteasoms bestimmt. Die Werte der beta-5-Untereinheit nahmen kurz nach der Geburt in ähnlichem Ausmaße sowohl bei WT als auch bei KO Mäusen ab. Um zu erforschen, ob die höhere UPS-Aktivität mit erhöhtem ATP-Verbrauch und darauffolgend mit erhöhter AMP-Kinase-Aktivität einhergeht, wurde die Konzentration der phosphorylierten Acetyl-CoA Carboxylase (pACC) per Western Blot ermittelt. Die Werte der pACC fielen kurz nach der Geburt ab. KO und WT unterschieden sich nicht.
Zusammengefasst zeigt diese Arbeit Veränderungen des UPS bei cMyBP-C-KO zu verschiedenen postnatalen Zeitpunkten, die im Fall der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität mit dem Ausmaß der Herzhypertrophie korreliert waren. Dies deutet auf Folgendes hin: i) UPS-Veränderungen stellen einen gebräuchlichen Umbaumechanismus bei Herzhypertrophie dar und können auch in Abwesenheit von cMyBP-C-Mutanten auftreten. ii) Die höhere Chymotrypsin-ähnliche Aktivität ist wahrscheinlich ein Kompensationsmechanismus gegen zunehmende Herzhypertrophie.

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