Charakterisierung eines Cysteinproteaseinhibitors des Malariaerregers Plasmodium berghei (Vincke und Lips, 1948)

Abstract

Jeder Organismus muss die Aktivität seiner Proteasen streng überwachen. Parasiten müssen zusätzlich auch zahlreiche Proteasen des Wirtes hemmen, die wichtige Funktionen bei der Pathogenabwehr übernehmen. Sowohl extrazelluläre Parasiten (z.B. Nematoden und Zecken) als auch intrazelluläre Erreger (z.B. Viren und Protozoen) sezernieren Cysteinproteaseinhibitoren, die sowohl ihre eigenen Proteasen als auch die Proteasen des Wirtes kontrollieren. Die Inhibitoren schwächen beispielsweise die lokale Immunantwort, verhindern im Fall der intrazellulären Erreger den Wirtszelltod oder steuern die Prozessierung von Adhäsionsproteinen, mit deren Hilfe sich die Parasiten im Wirt orientieren. Der Malariaerreger Plasmodium berghei exprimiert den Cysteinproteaseinhibitor PbICP (Plasmodium berghei inhibitor of cysteine proteases). PbICP ist ein ungewöhnliches Mitglied der Chagasinfamilieninhibitoren (ICPs, inhibitors of cysteine proteases, MEROPS-Familie 142). Im Rahmen dieser Arbeit wurde PbICP biochemisch, molekularbiologisch und strukturbiologisch näher charakterisiert. Das pbicp-Gen wird sowohl in Mückenstadien als auch in der exoerythrozytären und erythrozytären Entwicklungsphase im Nagerwirt transkribiert. Sporozoiten sezernieren den Cysteinproteaseinhibitor vor und nach Invasion von Hepatozyten. Wird PbICP vor der Invasion durch spezifische Antikörper abgefangen, reduziert sich die Anzahl der infizierten Leberzellen signifikant. Während der Entwicklung in den Leberzellen befindet sich PbICP vorwiegend in der parasitophoren Vakuole und im Parasitenzytosol. Am Ende der Leberphase wird PbICP ins Wirtszellzytosol freigesetzt. Hier könnte der Inhibitor die Aktivierung von Wirtszellproteasen verhindern und den eintretenden Wirtszelltod so abstimmen, dass er den komplizierten Freisetzungsprozess der Parasiten in den Blutstrom unterstützt. PbICP wird sowohl in der exoerythrozytären Phase als auch während der erythrozytären Phase proteolytisch prozessiert. Dabei wird der für die Plasmodien-ICPs spezifische N-terminale Teil des Proteins abgebaut, so dass nur die Chagasin-ähnliche Inhibitordomäne übrig bleibt. Um die Prozessierung auch in der Leberphase im Western Blot nachzuweisen, wurden transgene P. berghei hergestellt, die den Inhibitor als GFP-Fusionsprotein überexprimierten. Sowohl das Volllängenprotein als auch die prozessierte Form des Inhibitors (PbICP-C) wurden als rekombinante Proteine in E. coli hergestellt, gereinigt und in Kinetikstudien verwendet. Beide Proteine hemmten Papain, die Parasitenprotease Falcipain-2 und die Wirtsprotease Cathepsin L, nicht aber die Wirtsprotease Cathepsin B. PbICP-C wurde in großen Mengen gereinigt und in Zusammenarbeit mit Kristallographen der Universität Lübeck wurde die Kristallstruktur im Komplex mit Falcipain-2 gelöst. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über PbICP bilden die Basis für zahlreiche weitere Projekte, die unter anderem direkte medizinische Relevanz haben. Beispielsweise soll zukünftig untersucht werden, ob sich der Cysteinproteaseinhibitor des Malariaerregers als Vakzinekandidat eignet, ob PbICP das Immunsystem des Wirtes manipuliert und ob die Kristallstruktur bei der Entwicklung von selektiven Proteaseinhibitoren helfen kann.

Organisms strictly regulate their proteases to avoid undesired hydrolytic activity. Parasites have to control both their own proteases as well as the proteases of their host which are often involved in the defense against pathogens. Many intracellular and extracellular parasites secrete specific and tight-binding cysteine protease inhibitors that inhibit endogenous and host-derived proteases. The rodent malaria parasite Plasmodium berghei expresses PbICP (Plasmodium berghei inhibitor of cysteine proteases), an unusual member of the chagasin inhibitor family (ICPs, inhibitors of cysteine proteases, MEROPS family 142). In my PhD I characterized PbICP on the level of its biochemistry, cell and molecular biology as well as its structure. Transcription of the pbicp gene takes place in the mosquito stage as well as in the exoerythrocytic and erythrocytic stage in the vertebrate host. Sporozoites secrete PbICP prior to and after invasion of hepatocytes. Antibody-mediated blockage of the inhibitor significantly reduced the number of infected hepatocytes in a dose-dependent manner. During liver stage development, PbICP predominantly localizes in the parasitophorous vacuole and in the parasite cytoplasm. At the end of the liver stage, the inhibitor is liberated into the host cell cytosol. Here the released PbICP probably fine-tunes the unusual death of the host cell by blocking host cell proteases. PbICP is proteolytically processed during the exoerythrocytic and erythrocytic parasite stages. The Plasmodium-specific N-terminal extension region is cleaved off and degraded in this process, yielding the chagasin-like C-terminal inhibitor domain of PbICP. Transgenic parasites overexpressing PbICP-GFP confirmed the processing of the inhibitor. The full length PbICP as well as the processed form (PbICP-C) were expressed in E. coli, purified and used for kinetic studies. Both recombinant proteins inhibited papain, the parasite cysteine protease falcipain-2 as well as the host protease cathepsin L, but could not block the host protease cathepsin B. Recombinant PbICP-C was purified in large quantities, and in collaboration with crystallographers (University of Luebeck) the crystal structure of the PbICP-C in complex with falcipain-2 was solved. The results of this study provide the basis for future projects that might have a direct medical impact. For instance, it will be investigated if PbICP is a suitable vaccine candidate and if the protease inhibitor manipulates the immune system of the host. Structural information on PbICP might aid the development of selective protease inhibitors directed against specific proteases.