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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43218
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4321/


Charakterisierung eines Cysteinproteaseinhibitors des Malariaerregers Plasmodium berghei (Vincke und Lips, 1948)

Rennenberg, Annika

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Plasmodium berghei , exoerythrozytäre Phase , Proteaseinhibitor , Chagasin , Cysteinproteasen
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heussler, Volker (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.09.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 26.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Jeder Organismus muss die Aktivität seiner Proteasen streng überwachen. Parasiten
müssen zusätzlich auch zahlreiche Proteasen des Wirtes hemmen, die wichtige Funktionen bei der Pathogenabwehr übernehmen. Sowohl extrazelluläre Parasiten (z.B. Nematoden und Zecken) als auch intrazelluläre Erreger (z.B. Viren und Protozoen) sezernieren Cysteinproteaseinhibitoren, die sowohl ihre eigenen Proteasen als auch die Proteasen des Wirtes kontrollieren. Die Inhibitoren schwächen beispielsweise die lokale Immunantwort, verhindern im Fall der intrazellulären Erreger den Wirtszelltod oder steuern die Prozessierung von Adhäsionsproteinen, mit deren Hilfe sich die Parasiten im Wirt orientieren.
Der Malariaerreger Plasmodium berghei exprimiert den Cysteinproteaseinhibitor PbICP
(Plasmodium berghei inhibitor of cysteine proteases).
PbICP ist ein ungewöhnliches Mitglied der Chagasinfamilieninhibitoren (ICPs, inhibitors of cysteine proteases, MEROPS-Familie 142). Im Rahmen dieser Arbeit wurde PbICP biochemisch, molekularbiologisch und strukturbiologisch näher charakterisiert.
Das pbicp-Gen wird sowohl in Mückenstadien als auch in der exoerythrozytären und
erythrozytären Entwicklungsphase im Nagerwirt transkribiert. Sporozoiten sezernieren
den Cysteinproteaseinhibitor vor und nach Invasion von Hepatozyten. Wird PbICP vor
der Invasion durch spezifische Antikörper abgefangen, reduziert sich die Anzahl der infizierten Leberzellen signifikant. Während der Entwicklung in den Leberzellen befindet sich PbICP vorwiegend in der parasitophoren Vakuole und im Parasitenzytosol.
Am Ende der Leberphase wird PbICP ins Wirtszellzytosol freigesetzt. Hier könnte der Inhibitor die Aktivierung von Wirtszellproteasen verhindern und den eintretenden Wirtszelltod so abstimmen, dass er den komplizierten Freisetzungsprozess der Parasiten in den Blutstrom unterstützt. PbICP wird sowohl in der exoerythrozytären Phase als auch während der erythrozytären Phase proteolytisch prozessiert. Dabei wird der für die Plasmodien-ICPs spezifische N-terminale Teil des Proteins abgebaut, so dass nur die Chagasin-ähnliche Inhibitordomäne übrig bleibt. Um die Prozessierung auch in der Leberphase im Western Blot nachzuweisen, wurden transgene P. berghei hergestellt, die den Inhibitor als GFP-Fusionsprotein überexprimierten.
Sowohl das Volllängenprotein als auch die prozessierte Form des Inhibitors (PbICP-C)
wurden als rekombinante Proteine in E. coli hergestellt, gereinigt und in Kinetikstudien
verwendet. Beide Proteine hemmten Papain, die Parasitenprotease Falcipain-2 und die
Wirtsprotease Cathepsin L, nicht aber die Wirtsprotease Cathepsin B. PbICP-C wurde
in großen Mengen gereinigt und in Zusammenarbeit mit Kristallographen der Universität Lübeck wurde die Kristallstruktur im Komplex mit Falcipain-2 gelöst.
Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über PbICP bilden die Basis
für zahlreiche weitere Projekte, die unter anderem direkte medizinische Relevanz haben. Beispielsweise soll zukünftig untersucht werden, ob sich der Cysteinproteaseinhibitor des Malariaerregers als Vakzinekandidat eignet, ob PbICP das Immunsystem des Wirtes manipuliert und ob die Kristallstruktur bei der Entwicklung von selektiven Proteaseinhibitoren helfen kann.
Kurzfassung auf Englisch: Organisms strictly regulate their proteases to avoid undesired hydrolytic activity.
Parasites have to control both their own proteases as well as the proteases of their
host which are often involved in the defense against pathogens. Many intracellular and
extracellular parasites secrete specific and tight-binding cysteine protease inhibitors
that inhibit endogenous and host-derived proteases.
The rodent malaria parasite Plasmodium berghei expresses PbICP (Plasmodium
berghei inhibitor of cysteine proteases), an unusual member of the chagasin inhibitor
family (ICPs, inhibitors of cysteine proteases, MEROPS family 142). In my PhD I
characterized PbICP on the level of its biochemistry, cell and molecular biology as well
as its structure.
Transcription of the pbicp gene takes place in the mosquito stage as well as in the
exoerythrocytic and erythrocytic stage in the vertebrate host. Sporozoites secrete
PbICP prior to and after invasion of hepatocytes. Antibody-mediated blockage of the
inhibitor significantly reduced the number of infected hepatocytes in a dose-dependent
manner. During liver stage development, PbICP predominantly localizes in the
parasitophorous vacuole and in the parasite cytoplasm. At the end of the liver stage,
the inhibitor is liberated into the host cell cytosol. Here the released PbICP probably
fine-tunes the unusual death of the host cell by blocking host cell proteases. PbICP is
proteolytically processed during the exoerythrocytic and erythrocytic parasite stages.
The Plasmodium-specific N-terminal extension region is cleaved off and degraded in
this process, yielding the chagasin-like C-terminal inhibitor domain of PbICP.
Transgenic parasites overexpressing PbICP-GFP confirmed the processing of the
inhibitor.
The full length PbICP as well as the processed form (PbICP-C) were expressed in
E. coli, purified and used for kinetic studies. Both recombinant proteins inhibited
papain, the parasite cysteine protease falcipain-2 as well as the host protease
cathepsin L, but could not block the host protease cathepsin B. Recombinant PbICP-C
was purified in large quantities, and in collaboration with crystallographers (University
of Luebeck) the crystal structure of the PbICP-C in complex with falcipain-2 was
solved.
The results of this study provide the basis for future projects that might have a direct
medical impact. For instance, it will be investigated if PbICP is a suitable vaccine
candidate and if the protease inhibitor manipulates the immune system of the host.
Structural information on PbICP might aid the development of selective protease
inhibitors directed against specific proteases.

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