FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43258
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4325/


Aufklärung der Interaktion zwischen dem humanen Prionprotein und dem peptidischen Aggregationsinhibitor NMHRYPNQ

Investigation of the interaction between the human prion protein and the aggregationinhibitoric peptide NMHRYPNQ

Rehders, Dirk

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (5.657 KB) 


SWD-Schlagwörter: Prionprotein , Inhibitor , NMR-Spektroskopie , Peptide
Freie Schlagwörter (Deutsch): Protein-Ligand-Interaktion , Sättigungstransfer Differenz , Oberflächenplasmonenresonanz
Freie Schlagwörter (Englisch): protein ligand interaction , saturation transfer difference , surface plasmon resonance
Basisklassifikation: 35.62
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 27.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Der Erreger der Transmissiblen spongiformen Enzephalopathien ist das Prionprotein (PrP), das in zwei verschiedenen Konformationen vorkommt. Für die Konformationsänderung des zellulären PrPC in das pathogene PrPSc wird die Interaktion der beiden Proteinkonformere angenommen. Die Inhibition dieser Wechselwirkung oder die Stabilisierung des PrPC ist ein möglicher Ansatzpunkt für Therapeutika. Für das Peptid 153NMHRYPNQ160 (1) konnte in einem in vitro Assay eine solche Stabilisierung der PrPC Konformation nachgewiesen werden.
Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Bindungsinteraktion zwischen dem Peptid 1 und dem humanen Prionprotein genauer zu charakterisieren. Hierfür wurden 1H,15N-HSQC NMR-Experimente mit dem 15N-markierten hPrP(90-230) durchgeführt. Der Vergleich der chemischen Verschiebungen der Amidsignale bei An- und Abwesenheit des Peptids 1 lieferte zwei mögliche Bindungsregionen des Peptids auf dem Protein. Die erste Bindungsregion befindet sich am Ende der Helix-1, während die zweite Region im Bereich der Helix-3 lokalisiert ist. Eine Bestätigung wurde durch MALDI-TOF-MS H/D Austauschexperimente, in denen die Deuteriumeinbaurate einzelner Proteinfragmente in An- und Abwesenheit des Peptids 1 verglichen wurde, erreicht. Die Anwesenheit des Peptids 1 führte zu einer Verringerung der Einbaurate für Fragmente aus dem Bereich der Helix-3, wodurch diese als Bindungsregion bestätigt wurde.
Für die Bestimmung des Bindungsepitops seitens des Liganden wurde zunächst ein Alaninscan der Peptide 1 und 18 (149YYRENMHR156) durchgeführt und die Bindungseigenschaften mittels SPR-Experimenten bestimmt. Die Bindungskonstanten dieser Peptide variierten zwischen KD = 29 µM für das Peptid 153NMHRYANQ160 (15) und 4880 µM für das Peptid 149YYREAMHR156 (6). Der Vergleich aller erhaltenen Bindungskonstanten lieferte ein erstes Bindungsepitop, welches, mit Ausnahme des Pro158, die gesamte Sequenz des Peptids NMHRYPNQ umfasste. Für die Erstellung des Bindungsepitops auf atomarer Ebene wurden STD NMR-Experimente mit dem Peptid 153NAHRYPNQ160 (11) durchgeführt. Das Asn153 und das Tyr157 tragen hiernach nur in geringen Umfang zur Bindung bei, während für das Arg156 und das Glu160 starke STD-Prozente bestimmt werden konnten und somit einen großen Beitrag zu der Bindung aufweisen müssen. Obwohl bei der Substitution des Pro158 gegen Alanin kein Effekt auf die Bindungsstärke beobachtet werden konnte, wird vergleichsmäßig viel Sättigung auf die Protonen dieses Prolins übertragen, so dass von einem beträchtlichen Bindungsbeitrag ausgegangen werden muss, die jedoch von der Methylgruppe des Alanins vollständig kompensiert werden kann.
Um den Einfluss der einzelnen Aminosäuren auf das aggregationsinhibitorische Potential zu untersuchen, wurden neben den Peptiden des Alaninscans noch verschiedene, zum Teil verkürzte, Peptide synthetisiert und in einem in vitro Aggregationsassay untersucht. Obwohl kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Bindungsstärke und dem protektiven Potential erhalten werden konnte, wurde nachgewiesen, dass besonders das His155 für die inhibitorische Wirkung notwendig ist. Eine Verlängerung der Peptide über das C-terminale Gln160 oder das N-terminale Asn153 hatte keine Verbesserung dieser protektiven Wirkung zur Folge.
Durch CD-spektroskopische Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass die Konformation des PrPC während des Aggregationsassays durch die Anwesenheit des Peptids 153NMHRYPNQ160 (1) stabilisiert wird, während die Peptide 18 und 19 diesen stabilisierenden Effekt nicht aufweisen. In einem weiteren Assay, welcher auf der teilweisen Entfaltung des Prionproteins basiert, konnte keine stabilisierende Wirkung des Peptids nachgewiesen werden, was auf die denaturierenden Bedingungen des Assays zurückzuführen ist.
Für die Chitobiose konnte anhand von SPR-Messungen eine Bindung an das Prionprotein mit einem KD-Wert von 3666 µM nachgewiesen werden. Durch 1H,15N-HSQC NMR-Experimente mit dem 15N-markierten hPrP(90-230) konnte die Bindungsregion in einem Bereich zwischen der Helix-1 und dem Beginn der Helix-3 lokalisiert werden.
Die Verbesserung der Bindungseigenschaften des Peptids 1 sollte durch die Kombination der Bindungsbeiträge des Peptids und der Chitobiose erfolgen, indem die Kohlenhydratstruktur mittels eines 16 Å Linkers mit dem Peptid verbunden wurde. Die Synthese dieses Linkers erfolgte über die zweifache Kupplung von 5 Aminopentansäure an 1 Aminochitobiose und anschließender Verknüpfung an die Seitenkette eines Aspartats. Dieser Baustein wurde in Peptid 39 anstelle des Pro158 und in Peptid 40 anstelle des Arg156 eingebaut. Die Bindungskonstanten für die beiden Peptide betrugen KD = 87 µM für das Peptid 39 und KD = 52 µM für das Peptid 40 und konnten somit für das Peptid 39 nicht verbessert werden, während für das Peptid 40 eine 32fach bessere Bindungsaffinität im Vergleich zu dem Peptid 13 (153NMHAYPNQ160) erhalten wurde, indem das Arginin gegen Alanin substituiert wurde.

Kurzfassung auf Englisch: Transmissible spongiform enzephalopathies (TSE) are fatal neurodegenerative diseases caused by the prion protein. Pathogenesis of the prion protein is correlated with the conformational change from cellular prion protein (PrPC) to the pathogenic isoform PrPSc which is believed to be mediated by contact from PrPC with PrPSc. Thus, inhibition of this contact or stabilization of the cellular isoform is a potential route to drugs against TSE. The peptide 153NMHRYPNQ160 (1) was identified for binding to prion protein by screening of an octapeptide library.
For further investigation of binding interaction between prion protein and peptide 1, the binding region on the protein had to be identified. Therefore 1H,15N-HSQC NMR experiments were performed using the 15N-labelled hPrP(90-230). By observing changes in chemical shifts of amide resonances obtained from spectra recorded in absence and in presence of peptide 1 two different putative binding regions were assigned. The first region is located at the end of helix-1 while the second region is located at helix-3 of the prion protein. In order to obtain independent data MALDI-TOF-MS H/D exchange experiments of protein fragments in presence and in absence of peptide 1 were carried out. Addition of peptide 1 led to a decrease of deuterium incorporation rate for fragments from helix-3. Therefore, NMR and MS data led to the conclusion that the binding region of peptide 1 is located at helix-3 of the prion protein.
For identification of the binding epitope of peptide 1 an alaninscan of proteinsequences 153NMHRYPNQ160 (1) und 149YYRENMHR156 (18) were done and the resulting peptides were screened via SPR for their binding affinities. By comparison of these binding affinities a binding epitope could be established covering the whole sequence from peptide 153NMHRYPNQ160 excepted Pro158. STD NMR experiments with peptide 153NAHRYPNQ160 (11) gave a binding epitope at atomic resolution. The resulting binding epitope contains small contributions of Asn153 and Tyr157 and very strong STD effects for Arg156 and Glu160. Even for Pro158 strong STD effects were observed although substitution of this amino acid against alanine had no effect indicating that binding contributions of Pro158 can be compensated by the -methylgroup of alanine.
Results obtained by molecular docking experiments using the combined data from binding region on the protein and binding epitope on the peptide are in good agreement with experimental data and can be used for further development of the lead structure peptide 1.
The influences of individual amino acids on aggregation of the prion protein several shortened and elongated peptides as well as peptides from alanine scan were tested in an in vitro aggregation assay. Although no well defined correlation between binding affinity and protective potential were observable, His155 had a strong effect on inhibition of aggregation. Elongation of the peptide sequence at C-terminal part of Gln160 or N-terminal of Asn153 had no positive effect on the inhibitory potential.
Circular Dichroism experiments revealed a stabilization of the PrPC structure in presence of peptide 1 which did not occur in presence of peptides 18 and 19. Stabilisation of PrPC conformation was not observable in another assay using prion protein under denaturating condition. This can be explained by the assay conditions which also break down specific protein peptide interactions.
SPR experiments for chitobiose revealed a binding affinity to the prion protein of 3666 µM. The binding region was identified using 1H,15N-HSQC NMR experiments in a region of helix 1 and the beginning of helix 3. Although no specific binding epitope of chitobiose was observable by STD NMR experiments molecular docking experiments were accomplished.
To improve binding affinities of peptide 1 a combination of both binding epitopes of chitobiose and peptide 1 had been synthesized using a 16 Å linker between peptide and carbohydrate structure. Synthesis of this linker was carried out by coupling two monomers of 5 aminopentanoic acid to 1-aminochitobiose and final coupling to carboxylate in the side chain of aspartic acid. This building block was used in solid phase peptide synthesis of peptide 39 in which Pro158 was substituted against the asparagine-linked chitobiose building block and of peptide 40 in which Arg156 is substituted against this building block.
Binding affinities of these peptides were 87 µM for peptide 39 and 52 µM for peptide 40 as determined by SPR. While binding affinities of peptide 39 could not be improved peptide 40 has a 32 fold higher affinity relative to peptide 13 (153NMHAYPNQ160) in which Arg156 was substituted against alanine.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende