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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43278
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4327/


Molekulare Grundlagen der Mechanismen und Epidemiologie von Resistenzen gegenüber neuen Antibiotika bei Gram-positiven klinischen Isolaten aus dem Norddeutschen Raum

Saager, Björn

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SWD-Schlagwörter: Pyrosequencing , Linezolid , Dimethylierung
Basisklassifikation: 44.41
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 28.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Die Gram-positiven Erreger S. aureus und Enterococcus spp. gelten als eine häufigsten Ursachen für schwere Infektion wie z.B. Infektionen der Blutwege bei hospitalisierten Patienten. Der zunehmende Selektionsdruck in Krankenhäusern hat für nahezu allen Antibiotikaklassen gegenüber allen wichtigen Erregern zur Ausbildung von Resistenzen geführt, wobei in der Zukunft durch die fehlende Entwicklung neuer, innovativer Antibiotika die Bekämpfung von Infektionen sicherlich immer schwieriger werden wird.
Die durchgeführten Untersuchungen zur Entwicklung eines Pyrosequencing™-basierten Nachweisverfahrens der Dimethylierung des Adenins an Position 2058 der 23S rRNA zeigen, dass die Pyrosequencing™-Technolgie zur Detektion der Dimethylierung geeignet ist. Weiterhin konnten für die Quantifizierung der Dimethylierung wichtige Kenntnisse gewonnen werden. Dabei wurden verschiedene Sequenzier-Primer während der Pyrosequencing™-Reaktion, sowie die Verwendung von 2´-Desoxynukleotiden und 2´,3´-Didesoxynukleotiden während der Primer-Extension-Reaktion untersucht. Ebenso wurden alternative Methoden zur Detektion und Quantifizierung der Dimethylierung des Adenins an Position 2058 der 23S rRNA untersucht. Dabei ist die aussichtsreichste Möglichkeit die Auftrennung der nach einem neuen Primer-Design durch Primer-Extension gewonnenen cDNA-Fragmente mit Hilfe der Kapillar-Elektrophorese.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten in-vitro Empfindlichkeitsprüfungen an S. aureus -und Enterococcus spp. Isolaten liefern einen wertvollen Beitrag, da sie die lokale Resistenz-Lage an dem Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf zeitlich punktuell aufzeigen. Dabei wurde ein im Vergleich zu dem in der Routine-Diagnostik verwendeten Agar-Diffusions-Test detailliertes Bild durch die Bestimmung der MHK durch die Mikro-Dilutions-Methode erstellt. So wurden die für die Einschätzung der Resistenzlage wichtigen Parameter wie MHK50-und MHK90-Wert sowie die Spannweite der MHK-Werte ermittelt. Die über drei Jahre geführte Empfindlichkeits-Untersuchung zeigt somit für die in Deutschland verfügbaren Reserve-Antibiotika Daptomycin, Linezolid, Teicoplanin und Vancomycin ein günstiges Bild mit sehr geringen Resistenzraten für Linezolid, Teicoplanin und Vancomycin und einer vollständigen Empfindlichkeit für Daptomycin. Weiterhin wurde ein Anteil an MRSA Isolaten von 11,8 % sowie eine VRE-Rate von 3,4 % ermittelt. Das Auftreten von Resistenzen gegenüber Linezolid in 2,3 % der untersuchten Enterococcus spp. Isolate zeigt gleichzeitig, dass der Einsatz dieses Antibiotikums in Zukunft sehr restriktiv erfolgen sollte. So ist es erforderlich eine Prüfung des Resistenzstatus gegenüber Linezolid auf molekularer Ebene vor und während der Therapie vorzunehmen. Dabei ist von besonderem Interesse der G->T SNP an Position 2576 in der 23S rRNA, für dessen schnelle Detektion im Rahmen dieser Arbeit ein Pyrosequencing™-basiertes Nachweisverfahren entwickelt und angewandt wurde. Dabei wurde der erste klinische Fall eines MRSA Isolates mit Linezolid-Resistenz sowohl genotypisch als auch phänotypisch und auf einen möglicher Zusammenhang des Verlustes der Makrolid-Resistenz und der Aneignung der Linezolid-Resistenz in S. aureus untersucht. Dabei gilt es in der Zukunft zu klären, ob die gefundenen Veränderungen in der Regulatorregion des ermA-Gens und der mögliche Verlust des Plasmids mit der genetischen Information für das ermC-Gen von Bedeutung sind.
Weiterhin wurde die bisher noch nicht beschriebene genotypische Veränderung eines Vancomycin und Linezolid-resistenten E. faecium Isolates zurück zur vollständigen genotypischen Sensibilität mit Hilfe des entwickelten Pyrosequencing™-basierten Nachweisverfahrens untersucht. Durch die Ergebnisse dieser Untersuchungen, aber auch die Isolierung eines phänotypisch gegenüber Linezolid unauffälligen E. faecium Isolates mit genotypischer Prädisposition, welche zu einer möglichen rascheren Resistenzentwicklung gegenüber Linezolid führen könnte, konnte die enorme Wichtigkeit der schnellen und korrekten Detektion der Linezolid-Resistenz gezeigt werden. Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Assay zur Bestimmung des G->T SNP an Position 2576 in der 23S rRNA mit Hilfe der Pyrosequencing™-Technolgie hat sich zur Beantwortung dieser Fragestellung als sehr zuverlässig erwiesen.
Kurzfassung auf Englisch: The pathogen bacteria Staphylococcus aureus and Enterococcus spp. are the most common cause of bloodstream-infections in hospitalized patients. Increasing selective pressure has resulted in resistance to nearly all clinically relevant classes of antibiotics for almost all important bacteria associated with noscomial infections. Thus in the near future the appropiate therapy of those infections will presumably become more difficult, as development of new, innovative antibiotics for the successful treatment of nosocomial infections is lacking.
The studies conducted for establishing a pyrosequencing™-based detection of the dimethylation of the adenine at position 2058 in the 23S rRNA demonstrated the potential to detect the dimethylation. Furthermore the applied work for developing a pyrosequencing™-based approach to detect and quantify the dimethylation provides useful information for further investigations. So various sequencing-primers for the pyroseqeuncing™-reaction as well as the application of 2´-desoxynucleotides and 2´,3´-didesoxynucleotides during the primer-extension-reaction were tested. At last alternative ways for the detection and quantification of the dimethylation of the adenine at position 2058 in the 23S rRNA were tested. The most promising way should be the separation by capillar electrophoresis of the primer-extension-reaction produced cDNA-fragments with prior development of a new 5´-6-FAM-labeled primer.
Present result of the in-vitro susceptibility-testing provide data on local status of resistance at the University Medical-Center of Hamburg-Eppendorf in Germany. During this work used microbroth dilution in contrast to in routine-diagnostics commonly used agar-diffusion test provided much more differentiated results. Thus for the evaluation of resistance the MIC50-values and MIC90-values as well as range were determinated. The data being collected during the in-vitro susceptibility-testing for three years show an optimistic perspective for the last-line antibiotics available in Germany (daptomycin, linezolid, teicoplanine and vancomycin), with low rates of resistance for linezolid, teicoplanine and vancomycin and complete susceptibility for daptomycin. Furthermore a resistance rate of 11,8 % for MRSA and 3,4 % for VRE could be detected.
The emergence of resistance against linezolid (2,3 % of the analyzed isolates of Enterococcus spp. showed resistance towards linezolid) points out the need for restrictive application of this last-line antibiotic. Furthermore the state of resistance should be analyzed very carefully before and during the treatment with linezolid. For this question a pyrosequencing™-based assay to detect the G->T SNP at position 2576 in the genes encoding for the 23S rRNA has been developed and applied. During this thesis the first case of a linezolid-resistant MRSA Isolate has been successfully analyzed genotypically and phenotypically, as well as the connection between the loss of resistance to the classes of macrolides and the acquisition of resistance to linezolid. For further studies, notably the role of the finding of genetic changes in the regulatory region of the ermA-gene and a proposed loss of the plasmid harbouring the genetic information for the ermC-gene should be analyzed further.
The molecular characterization of a novel genotype, i.e. the reversion of vancomycin and linezolid resistance to complete susceptibility in an E. faecium isolate have been analyzed. Furthermore the identification of a phenotypically susceptible but genotypically affected E. faecium isolate with the possibility of a much more rapid development of resistance to linezolid points out the great importance of the fast and reliable detection of resistance to linezolid with the pyrosequencing™-based assay developed during this thesis.

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