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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-43917
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4391/


CAPILLARY LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY AND LASER INDUCED PLASMA BREAKDOWN SPECTROSCOPY FOR ARSENIC SPECIATION AND METABOLITES IN MARINE BIOTA SAMPLES

Staykova Daneva, Elisa

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SWD-Schlagwörter: HPLC-MS , ICP-Massenspektrometrie , Elektrospray-Ionisation , Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie , Arsenik , Speciation
Freie Schlagwörter (Deutsch): HPLC-ICP-MS , HPLC-ESI-MS/MS , marine algae
Freie Schlagwörter (Englisch): capillary HPLC-ICP-MS , capillary HPLC-ESI-MS/MS , marine biota , algae
Basisklassifikation: 35.29 , 35.60 , 35.26 , 35.25 , 35.30
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Broekaert, José Alfons Clement (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 01.12.2009
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wird eine Verbindung von cHPLC mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP), Elektrospray (ESI) und Massenspektrometrie (MS) verwendet. Sie befasst sich mit der Analyse von Zerfallsprodukten des Arsens (As) (oder Arsenverbindungen) in verschiedenen Meerwasser-Proben. Zwei analytische Strategien sind für die Bestimmung von Arsenverbindungen angewendet worden: cHPLC-MS und die neue Laser-induzierte Zerfalls- Spektroskopie (LIBS), die auf der Plasmaerzeugung aus mono-zerstreuten Mikro-Tröpfchen (LADROP-LIBS) basiert. Beide Techniken und deren Möglichkeiten wurden kritisch für die Analyse der Meerwasser-Proben verglichen.
Viele organische Arsenverbindungen, mit unterschiedlich toxischen Wirkungen, sind in der Meeresfauna und -flora vorzufinden. Die organischen Arsenverbindungen sind von geringerer Toxizität oder scheinen sogar nicht toxisch zu sein gegenüber As [1]. Meeresalgen sammeln anorganisches Arsen und wandeln dieses in dimethylarsinoylriboside Derivate (Arsenzucker) und andere methylierten Arsenverbindungen um, während bei Meerestieren Arsenobetaine und einige methylierte Arsenikale als Endprodukt überwiegen [51].
Die cHPLC, entweder mit elementarem (ICP) oder molekularem (ESI) MS online gekoppelt, wurde für die Bestimmung arsenhaltiger Verbindungen im Kabeljau, Dornhai sowie braunen und roten Meeresalgen verwendet. Untersucht wurde weiterhin die Effektivität einiger kommerziell und betriebsintern verpackter cHPLC-Säulen. Nach sorgfältiger Optimierung stellte sich die Hamilton-PRP-X100 Säule, welche aus einem starken Anionenaustauschharz (SAX) (10 µm Partikelgröße) besteht, als optimale Lösung dar, um eine simultane Trennung der anionisch, neutral und amphoter anorganischen und organischen Arsenverbindungen zu erreichen. Die cHPLC, mit einem starken Kationenaustauschharz (SCX) als Säule, wurde als ergänzende Methode angewendet. Ziel war die Bestätigung der Resultate die unter Anionenaustauschbedingungen erzielt wurden, insbesondere das Vorkommen des Tetramethylarsonium (TMAs) Ion im Kabeljauextrakt. Weiterhin sollte zusätzlich die Trennung von As (III), Arsenobetaine (AsB), Arsenocholine (AC) und Arsenzuckern erreicht werden, obgleich Phosphatribose in gewissen Ausmaßen mit TMA Oxid (TMAO) und As(V) koeluiert.
Die Kopplung von SAX-cHPLC mit ICP-MS zeigte großes Potenzial für die Bestimmung der unterschiedlichen Arsenverbindungen in der Meeresflora und -fauna nach Flüssig/ Flüssig-Extraktion mit einer Wasser-Methanol-Mischung. Arsen-Konzentrationen von 0.7 bis 24 µg/g wurden als Arsenverbindungen bei Fischen und Algen beobachtet. Sie wurden durch die SAX cHPLC, on-line gekoppelt mit dem ESI-MS/MS, bestätigt und identifiziert. AsB und Arsenzucker erwiesen sich als die am häufigsten vorkommenden Arsenverbindungen in beiden Algen. Weiterhin wurden Unterschiede in der Verteilung von As innerhalb verschiedener Arten der roten und braunen Algen festgestellt. Obgleich die Hauptkomponenten in den Algen Arsenoriboside und AsB sind, wurden auch geringe Spuren von Dimethyl-arsenige Säure (DMA), As (V) und andere Arsen-bezogene Verbindungen (z.B. Phytochelatine) mit Hilfe der cHPLC, die mit ICP-MS und ESI-MS/MS gekoppelt war, bestimmt. Die Nachweisgrenze des Verfahrens lag auf dem sub-pg Niveau für Arsenverbindungen bei 0.1 pg AsB. Die Genauigkeit der Messungen wurde durch die Analyse eines zertifizierten Referenzmaterials (CRM) DORM-2 überprüft und die erzielten Resultate stimmten sehr gut mit den zertifizierten Werten überein.
Sechs weitere, bis jetzt nicht identifizierte Verbindungen konnten in den SAX-cHPLC-Chromatogrammen, gekoppelt mit ICP-MS der Algen-Extrakte beobachtet werden. Diese Verbindungen wurden weiter mit Hilfe von cHPLC, gekoppelt mit ESI-MS, untersucht. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von As-Komponenten an, die Thiolalkoholgruppen, bestehend aus Glutathion (GSH) und von Glutathion abgeleitete Peptide, sogenannte Phytochelatine (PC), enthalten. Oligomere von zwei bis sechs Untereinheiten, beziehungsweise PC2 und PC6, wurden in den Algen-Extrakten gefunden, ebenso wie DMAs-PC, As-PC3 und iso-PC5-As Komplexe. Die cHPLC in Verbindung mit ESI-MS/MS erwies sich, wie erwartet, als sehr leistungsfähiges und wertvolles Werkzeug für die Kennzeichnung von Bio-Liganden, die von den Algen als Reaktion auf eine As-Aussetzung synthetisiert worden waren.
Das neuartige Analysesystem basierte auf LIBS, welches ein Plasma verwendet, das durch mono-zerstreute Mikro-Tröpfchen generiert wird. Es wird als LADROP-LIBS bezeichnet und wurde im GKSS Forschungszentrum Geesthacht, Deutschland, für die Bestimmung von Arsenverbindungen und/oder Element-Analytik entwickelt. Diese Technik wurde ursprünglich für die Bestimmungen von Na, Ca, Mg und Cu entwickelt, wobei die Bestimmung von Arsenverbindungen damals nicht möglich war. Die cHPLC wurde online gekoppelt mit dem LADROP-LIBS unter Verwendung einer betriebsintern verpackten SCX-Hamilton-PRP-X200 Säule und für eine Trennung und Bestimmung der Na-, Cu-, Ca- und Magnesium-Ionen in zwei Meerwasser-CRMs mit unterschiedlichem Salzgehalt, SLEW-3 und NASS-5, verwendet. Die ergänzende Anwendung von cHPLC-ICP-MS und von cHPLC-ESI-MS/MS erwies sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Arsenverbindungen in den komplexen biologischen Proben wie z.B. Meeresalgen. Die cHPLC in Verbindung mit ICP-MS und LADROP-LIBS, zeigte ein großes Potenzial für eine Echtzeitbestimmung nach einer Trennung der in Frage kommenden Komponenten. Diese besitzt ein hohes Nachweisvermögen und ist für verschiedene Elemente einsetzbar.
Kurzfassung auf Englisch: In modern separation science the popularity of capillary liquid separation technique has been rapidly expanding. This study makes use of a coupling of cHPLC to inductively coupled plasma (ICP)- and electrospray (ESI)- mass spectrometry (MS) and deals with their application for trace speciation analysis of arsenic (As) in various marine samples. On-line coupled systems are preferable for speciation analysis as they avoid contamination and/or disintegration or change of the original metal or metalloid species. Two analytical strategies have been evaluated for the determination of As species: cHPLC-MS and a novel laser-induced breakdown spectroscopy method based on plasma generation of mono-disperse microdroplets (LADROP-LIBS). The potential of all these techniques were critically compared for the analysis of marine samples.
Many organic arsenic compounds of variable toxicities are found in marine fauna and flora. The organoarsenicals are of lower toxicity or appear to be non-toxic compared to inorganic As [1]. Marine algae appear to accumulate and transform inorganic arsenic mainly to dimethylarsinoylriboside derivatives (arsenosugars) and other methylated arsenic compounds, while in marine animals arsenobetaine and some methylated arsenicals are predominant [51].
cHPLC coupled on-line either with elemental (ICP) or molecular (ESI) MS was used for arsenic speciation analysis in codfish, dogfish, brown and red marine algae. A major aim was development and application of highly effective separation method based on cHPLC for the determination of trace amounts of arsenic species in aquatic samples. The performance of several commercial and in-house packed cHPLC columns was also studied. After a careful optimisation, a strong anion-exchange (SAX) Hamilton PRP-X100 resin, which was packed in-house into a cHPLC column (250 x 0.5 mm, 10 µm particle size) showed to be the optimum for a simultaneous separation of anionic, neutral and amphoteric inorganic and organoarsenic compounds. cHPLC using a strong cation-exchange (SCX) resin was applied as a complementary method, so as to confirm the results obtained under SAX conditions, particularly the presence of the tetramethylarsonium (TMAs) ion in codfish and to realise the separation of As (III), arsenobetaine (AsB), arsenocholine (AC) and arsenosugars, although phosphate-ribose co-eluted to some extent with TMA oxide (TMAO) and As(V).
SAX cHPLC coupled to ICP-MS showed to have a great potential for the determination of different As species in marine biota after liquid/liquid extraction with a water-methanol mixture. Concentrations of As ranging from 0.7 to 24 µg/g of As species were observed in fish and algae. They were confirmed and identified by on-line SAX cHPLC coupled to
ESI-MS/MS. AsB and arsenosugars were shown to be the most abundant forms of As in both algae. Differences in the distribution of different As species in red and brown algae were also found to occur. Although the main species in algae are arsenoribosides and AsB, small traces of dimethylarsinic acid (DMA), As(V) and other As related compounds (e.g. phytochelatins) were detected by cHPLC coupled to ICP-MS and ESI-MS/MS. The newly developed complementary procedures provided higher chromatographic efficiency, resolution and selectivity and a high sensitivity for As speciation in marine algae. The detection limit of the method was at the sub pg level for As species (0.1 pg of AsB). The accuracy of the measurements was tested by analysis of certified reference material (CRM) dogfish DORM-2 and the results obtained were in very good agreement with the certified values.
Six more, so far unidentified compounds could be observed in the SAX chromatograms of cHPLC coupled to ICP-MS of the algae extracts and were further investigated by cHPLC coupled to ESI-MS. The results indicated a presence of As compounds containing thiol groups of glutathione (GSH) and glutathione derived peptides, so called phytochelatins (PCs). Oligomers of two to six sub-units, respectively PC2, and PC6, were found in the algae extracts as well as DMAs-PC, As-PC3 and iso-PC5-As complexes. cHPLC coupled to
ESI-MS/MS, as expected has proved to be a very powerful and valuable tool for the characterisation of bio-ligands synthesised by the algae in response to As exposure. Such compounds are unlikely to be toxicologically significant because of their lower concentrations, but they may offer information on the metabolism and the origin of As compounds in marine algae.
The novel analytical system built on the base of LIBS of plasma generated mono-disperse microdroplets, referred to as LADROP-LIBS, was developed at GKSS Research Centre in Geesthacht, Germany for As speciation and/or elemental analysis. The technique was studied for determinations of Na, Ca, Mg and Cu, because As speciation was not possible. The results showed the potential of the piezoelectric droplet generation principle as a new sample introduction system for element specific detectors coupled to micro scale liquid separation methods, such as cHPLC, especially for applications with sub-µL sample volumes. cHPLC on-line coupled to LADROP-LIBS using the in-house packed SCX Hamilton PRP-X200 column was applied for a separation and determination of Na, Cu, Ca and Mg ions in two seawater CRMs with different salinity - SLEW-3 and NASS-5.
The complementary application of cHPLC-ICP-MS and cHPLC-ESI-MS/MS provided a powerful tool for the determination of As species in complex biological samples, such as marine algae. cHPLC coupled to ICP-MS and LADROP-LIBS were shown to have potential for real-time analyses following the separation of the compounds of interest. They also have multi-element capability and high detection power.

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