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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-44025
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/4402/


Interaktionspartner des Neuronalen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) in der Maus (Mus musculus)

Interaction Partners of Neuronal Calcium-Sensor-1 (NCS-1) in Mouse (mus musculus)

Stockebrand, Malte Cord

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SWD-Schlagwörter: Calcium-bindende Proteine , Protein-Protein-Wechselwirkung
Freie Schlagwörter (Englisch): neuronal calcium sensor
Basisklassifikation: 35.70 , 42.1
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 10.12.2009
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde einerseits der Einfluss der N-Myristylierung auf die intrazelluläre Lokalisation des Neuronalen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) in kultivierten Zelllinien untersucht, andererseits wurden, mit Hilfe transgener Mäuse, NCS-1-Interaktionspartner identifiziert.
Zellkulturexperimente mit stabil transfizierten Zellen bestätigten die, in anderen Zellen bereits gezeigte, Notwendigkeit der N-Myristylierung für die Membranlokalisation und für die Ca2+-abhängige Membranassoziation von NCS-1.
Es waren bereits NCS-1-Funktionen bei der Regulation der synaptischen Stärke und des Vesikeltransports beschrieben worden. Frq1, das NCS 1-Ortholog der Hefe, ist eine regulatorische Untereinheit der Phophatidylinositol 4-Kinase Pik1, mit einer wichtigen Funktion beim Vesikeltransport am Golgi-Apparat. Auf Grund der hohen Sequenz-Konservierung des NCS-1 Proteins, über die Grenzen verschiedener Phylae hinaus, wurde die Hypothese formuliert, dass Säuger-NCS-1 in vivo ebenfalls bei der Regulation des vesikulären Transports am Golgi-Apparat beteiligt ist.
Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden transgene Mauslinien etabliert, die GFP-markiertes NCS-1 (NCS-1-EGFP) im Vorderhirn exprimierten. Verglichen mit der endogenen NCS-1-Expression war die Transgen-Expression in diesem Gewebe verstärkt. Die transgenen Mäuse zeigten keinen auffälligen Phänotyp. Es wurde allerdings in Gewebeschnitten des Hirns transgener Mäuse eine veränderte Erregbarkeit bestimmter Synapsen (am Tractus perforans im Hippocampus) festgestellt.
Mit dem Ziel NCS-1-Interaktionspartner zu identifizieren, wurden NCS-1-EGFP-enthaltende Proteinkomplexe, durch Gelchromatographie und anschließende Immunpräzipitation mit anti-GFP-Antikörpern, aus Vorderhirn-Lysat transgener Mäuse isoliert. Das Immunpräzipitat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. In einem Kontrollexperiment wurde Vorderhirn-Lysat von transgenen Mäusen, die nur EGFP unter Kontrolle desselben Promotors exprimierten, sowie von Wildtyp-Mäusen eingesetzt. Spezifische Coomassie-gefärbte Proteinbanden, die nicht im Kontrollexperiment auftraten, wurden ausgeschnitten und, nach tryptischer Hydrolyse, durch an FLüssigchromatographie gekoppelte Tandem-Massenspektroskopie (LC-MS/MS) analysiert.
In der MS-Analyse wurden mehrere potentielle NCS-1-Interaktionspartner identifiziert. Ein Pik1-Ortholog befand sich allerdings nicht darunter. Stattdessen wurden zwei neue potentielle NCS-1-Interaktionspartner identifiziert, Bet3 und SNAP-47, die beide eine Funktion beim Vesikeltransport haben. Die Interaktion beider Proteine mit NCS-1 wurde durch Co-Immunpräzipitation mit NCS-1-Antikörpern bestätigt. Als Ausgangsmaterial diente dabei Hirnlysat von Wildtyp-Mäusen oder in Kontrollexperimenten Hirnlysat von NCS-1-Knockout-Mäusen. Die NCS-1-Interaktionen mit Bet3 und SNAP-47 waren Ca2+-abhängig. Immunfluoreszenz-Analysen zeigten die perinucleäre Co-Lokalisation von NCS-1 mit Bet3 und SNAP 47. Diese Ergebnisse wurden zusammengefasst in einem Modell, das eine NCS-1-Funktion bei der Ca2+-abhängigen Regulation des vesikulären Transports am Golgi-Apparat im Säuger impliziert.
Obwohl keine Konservierung der Interaktionspartner festgestellt wurde, geht die strukturelle Konservierung zwischen Frq1 und NCS-1 also einher mit der Konservierung einer Funktion beider Proteine beim vesikulären Transport am Golgi-Apparat.
Kurzfassung auf Englisch: This work addressed on one hand the influence of N-myristoylation on localization of neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) in cell culture, on the other hand the identification of NCS-1 interaction-partners using transgenic mice as starting point.
Cell culture experiments in stably transfected cell lines confirmed the importance of N-myristoylation for membrane localization and Ca2+-dependent membrane association of NCS-1, as previously described for other cell lines.
NCS-1 had already been implicated in regulation of synaptic strength and vesicular trafficking. The yeast NCS-1 orthologue Frq1 functions as a regulatory subunit of phosphatidylinositol 4-kinase Pik1, playing an important role in Golgi function and vesicle trafficking. Given the high sequence conservation of NCS-1 proteins across phyla, I hypothesized that mammalian NCS-1 also functions in vesicular trafficking at the Golgi.
To address this hypothesis, I generated transgenic mice expressing GFP-tagged NCS-1 (NCS-1-EGFP) in forebrain. In comparison with endogenous NCS-1 expression levels in wildtype mice, transgene expression levels were increased. Transgenic mice displayed no obvious excitability phenotype. However, isolated brain tissue exhibited altered excitability of certain synapses (i.e. at the hippocampal perforant path).
To identify NCS-1 interaction partners I prepared forebrain lysates and isolated NCS-1-EGFP containing protein complexes by size-exclusion chromatography followed by immunoprecipitation with anti-GFP antibodies. Immunoprecipitated proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. For control, I used brain lysates from transgenic mice expressing only EGFP under control of the same promoter as well as from wildtype mice. Specific coomassie-stained protein bands, not apparent in controls were isolated and characterized by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
This analysis indicated several candidate interaction partners of NCS-1, but a mammalian Pik1 orthologue was not among them. Instead, I identified two novel candidate proteins, Bet3 and SNAP-47, which both have an, albeit ill-defined, role in vesicular trafficking in eukaryotic cells. Their interaction with NCS-1 could be confirmed by co-immunoprecipitation with anti-NCS-1 antibodies from brain lysate of wild type mice using NCS-1 knockout mice for control. These interactions were Ca2+-dependent. Immunofluorescence analysis showed perinuclear co-localization of NCS-1 with Bet3 and SNAP-47. These results were summarized in a model with mammalian NCS-1 playing a role in Ca2+-dependent regulation of intracellular vesicle trafficking in vivo.
Although conservation of interaction partners was not confirmed, structural conservation between Frq1 and NCS-1 went along with conservation of a function for both proteins in vesicle trafficking at the Golgi.

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