Stereological analyses of neurons and glial cells in the lesioned and unlesioned spinal cord of wild-type and CHL1-deficient mice

Abstract

Das beschränkte Regenerationspotenzial des Säugetierrückenmarks ist eine ernste Herausforderung für die Medizin und Wissenschaft. Veränderungen sowohl in den Neuronen als auch in Glia-Zellen der verletzen Region sind Ursache für die mangelnde Regeneration. Ziel der Forschung ist es, die Pathophysiologie der Rückenmarksverletzung besser zu verstehen, um vorteilhafte Bedingungen für die neuronale Regeneration zu schaffen. Bisherige Arbeiten lieferten umstrittene Ergebnisse über die Modifizierung und Zellzahl im Lumbalmark. Aus diesem Grund sollte eine quantitative und immunohistochemische Auswertung von definierten Zelltypen neue Einblicke in die Pathophysiologie der Rückenmarksverletzung gewähren. Die vorliegende Arbeit bestand darin, Veränderungen in Zellpopulationen im distalen Rückenmark quantitativ zu ermitteln und damit die Frage zu klären, ob solche Veränderungen, wie etwa Verluste an Nervenzellen, zu der schlechten Regeneration nach Rückenmarksläsionen beitragen. Um diese Fragestellung zu beantworten, wurden CHL1 knock-out und wild-typ Mäuse verwendet.

CHL1 ist ein Zelladhäsionsmolekül mit einer 34 %ige Homologie zu L1. Es besteht aus 1209 Aminosäuren und hat eine berechnete molekulare Masse von 135 kD. Die Expression von CHL1 scheint auf das Nervensystem beschränkt zu sein. Neue Ergebnisse deuten eine wichtige Rolle von CHL1 im läsionierten Nervengewebe an, da CHL1 auffällig hochreguliert ist in Schwann Zellen und Sinnesneuronen nach Verletzung. Die Hochregulation der CHL1-Expression wird durch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF-2 aus den Astrozyten der glialen Narben veranlasst, was als mögliche Ursache der hemmenden Wirkung identifiziert wurde. In vitro Ergebnisse haben außerdem gezeigt, dass CHL1 den neuronalen Auswuchs behindert. Jakovcevski u.a. zeigten, dass erwachsene CHL1-knock-out Mäuse nach Kompressionsverletzung am Rückenmark besser genesen als wild-typ Mäuse. CHL1 scheint einen negativen Einfluss auf die Regeneration zu haben.

Die bemerkenswerteste Entdeckung war die Schrumpfung des Lumbalmarks sowohl in CHL1-wild-typ als auch knock-out Mäusen auf ca. zwei Drittel des Ausgangswertes. Dieser Volumenverlust war zu erwarten, da axonale Entartung und daraus folgende Demyelination hervorstechende Merkmale der Pathophysiologie nach Rückenmarksverletzung sind. Die Analysen zeigten auch, dass sechs Wochen nach einer Kompression des thorakalen Rückenmarks von Wildtypmäusen die Gesamtzahl der Nervenzellen (NeuN+) sowie die Anzahl der ChAT+ Motoneurone und der PV+ Interneurone im lumbalen Rückenmark im Vergleich zu intakten Tieren massiv reduziert sind. Ebenso reduziert ist die Anzahl der CNPase+ Oligodendozyten. Im Gegensatz dazu zeigen die S-100+ Astrozyten keine Veränderung und die Anzahl der Iba1+ Mikrogliazellen ist massiv gesteigert. Vergleichbare Veränderungen wurden bei lädierten CHL1-defizienten Mäusen gefunden.

Poor recovery from severe injuries of the spinal cord in adult mammals including humans is primarily attributed to the low intrinsic potential of CNS neurons to regenerate their severed axons and to regeneration-inhibiting factors in and around the site of injury. To what degree changes in the spinal cord distal to the site of injury, such as, for example, neuronal death and glial cell loss or proliferation, contribute to the pathology after SCI is poorly understood. Here we addressed this question utilising a well-established injury paradigm, severe low-thoracic compression injury in adult mice. Using immunohistochemical cell markers and stereology, we estimated total numbers of different neuronal and glial cell types in the lumbar spinal cord 6 weeks after SCI, a time-point at which the very limited spontaneous functional recovery in this model has almost reached a maximum. Analysis of uninjured and injured C57BL/6J mice revealed dramatic injury-related structural alterations in the lumbar spinal cord. Gray and white matter volumes were reduced by one-third compared with normal. The number of all neurons (NeuN+) and that of ChAT+ motoneurons in the ventral horn were reduced, compared with uninjured mice (by 24% and 35%, respectively) and fewer PV+ interneurons were detectable in both the ventral (-40%) and dorsal horn (-50%). While SCI did not affect the S-100+ astrocytes, the CNPase+ oligodendrocytes in the white matter were reduced in number by 32%. And finally, a remarkable degree of microgliosis was found in the ventral horn (90% more Iba1+ microglial cells compared with uninjured mice). Similar injury-related alterations were found in mice deficient in the expression of the cell adhesion molecule CHL1 (close homologue of L1), mice previously shown to recover some functional abilities better than wild-type mice after compression SCI. While these results cannot explain the different outcomes in wild-type and CHL1-deficient mice, they suggest that neuronal and glial changes in the distal spinal cord are factors limiting, irrespective of genotype, recovery of function after SCI. In particular, reduction in the numbers of ChAT+ motoneurons and PV+ interneurons, whether due to reduced expression of ChAT and PV, molecules crucial for normal cell functions, and/or to cell death, must have consequences. Also the finding of a reduced number of CNPase+ oligodendrocytes in the white matter is in line with the notion that oligodendrocyte death and axonal de-/hypomyelination play a central role in SCI pathology. The results of this study warrant further investigations on the contribution of specific cell alterations in the distal spinal cord to disabilities after SCI.