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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-44599
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4459/


Interleukin-6-Rezeptor-spezifische RNA-Aptamere

RNA aptamers specific for the interleukin-6 receptor

Meyer, Cindy

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Aptamer , RNS , RNS-Bindung , Interleukin 6 , Ligand <Biochemie> , Wirkstoff-Rezeptor-Bindung , Rezeptor , Auslese
Freie Schlagwörter (Deutsch): SELEX, Zytokine
Freie Schlagwörter (Englisch): SELEX, cytokine , interleukin-6, receptor , aptamer , RNA , DNA
Basisklassifikation: 35.75
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 28.01.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Interleukin-6 (IL-6) ist ein multifunktionales pro- und anti-inflammatorisch wirkendes Zytokin, welches das Wachstum und die Differenzierung verschiedener Gewebe beeinflusst. Es spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation von Immunreaktionen und der Akute-Phase-Reaktion. An Zielzellen stimuliert IL-6 seinen Rezeptorkomplex bestehend aus zwei Rezeptor¬untereinheiten, dem IL-6-Rezeptor (IL 6R) und dem Glykoprotein 130 (gp130).
Im Mausmodell konnte beobachtet werden, dass IL-6 das Fortschreiten und die Pathologie einer Vielzahl verschiedener Erkrankungen fördert, wie beispielsweise bei Morbus Crohn, Rheumatoide Arthritis und entzündlichem Darmkrebs. Eine potentielle therapeutische Strategie stellt demnach die Hemmung der IL-6-vermittelten Signalgebung dar, beispielsweise durch eine Blockade der Interaktion zwischen IL-6 und IL 6R oder durch die Blockade der Bindung des IL 6/IL-6R-Komplexes an die Signal-weiterleitende Rezeptor-Untereinheit gp130.
Eine vielversprechende Möglichkeit hierfür böte der Einsatz von Aptameren. Aptamere sind kleine einzelsträngige Nukleinsäuren mit definierter dreidimensionaler Struktur, die ihre Zielmoleküle hoch affin und spezifisch binden können.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung von RNA-Aptameren mit Spezifität für den löslichen IL-6R (sIL-6R), d. h. den IL-6R ohne zytoplasmatische und Transmembran-Domäne. Die Anwendung des in vitro Selektionsverfahrens SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) ermöglichte die Isolation von sechs IL 6R-spezifischen Ribonukleinsäuren (106 nt), welche sich durch ein gemeinsames, G-reiches Konsensusmotiv auszeichneten. Eine dieser Spezies, das Aptamer 16 3, wurde weiter mit Hilfe von Filterbindungsstudien analysiert. Die Dissoziations¬konstante, welche die Affinität zwischen Aptamer und sIL-6R beschreibt, lag im unteren nanomolaren Bereich (Kd ~ 20 nM). In Gel-Shift-Assays konnte diese hoch affine Interaktion bestätigt werden. Das Aptamer besitzt eine signifikante Spezifität für das Targetprotein. Mit keinem anderen getesteten Protein konnte eine Interaktion mit dem Aptamer beobachtet werden. Die Verkürzung des Aptamers 16-3 resultierte in einem 47mer (16-3_B) mit zum Wildtyp-Aptamer vergleichbaren Eigenschaften. Selbst eine auf 19 Nukleotide verkürzte Variante konnte noch immer mit dem Zielprotein wechselwirken. Weitere biochemische Analysen führten zu der Hypothese, dass das Aptamer einen G-Quadruplex ausbildet.
In Kompetitionsstudien konnte gezeigt werden, dass das Aptamer nicht mit den natürlichen IL-6R-Liganden, IL-6 und gp130, kompetierte. Es war zur Erkennung des sIL-6R im Komplex mit diesen Molekülen befähigt. Interaktionen des Aptamers mit Hyper-IL-6, einem IL 6/sIL 6R-Fusionskonstrukt, allein oder im Komplex mit gp130 bestätigten diese Beobachtungen. Die Anwendung der Durchflusszytometrie führte zu der Erkenntnis, dass die Aptamere spezifisch an murine BAF/3-Zellen binden konnten, die den nativen IL-6R auf ihrer Oberfläche präsentieren.
In zukünftigen Studien bleibt nun zu klären, ob die Aptamere lediglich eine markierende Funktion besitzen oder ob diese hoch affinen Ribonuklein¬säuren in vivo in der Lage sind, die Wirkung des IL-6R zu blockieren. Möglicherweise könnten diese selektierten IL-6R-spezifischen Aptamere der Entwicklung und Optimierung von Wirkstoffen zur Behandlung IL 6R-bedingter Krank¬heiten dienen. Denkbar wäre auch die Darstellung von Komplexen aus Aptamer und diversen Liganden (z. B. auch Antisense-Nukleinsäuren oder Toxinen), die die IL-6-Bindung blockieren oder im Komplex mit dem Rezeptor internalisiert werden könnten.
Kurzfassung auf Englisch: Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional pro- and anti-inflammatory cytokine which regulates the growth and differentiation of various tissues. It plays a pivotal role in immune responses and acute phase reactions. In various diseases, for example rheumatoid arthritis and colon cancer, elevated IL-6 levels were observed, promoting the progression and pathology of these diseases. The inhibition of the IL 6 signal transduction pathway via the IL-6 receptor system therefore seems to be a potentially useful therapeutic strategy. Several approaches can be proposed: the blockade of IL-6 binding to the IL-6 receptor (IL-6R) or the blockade of IL 6/IL-6R complex binding to the signal transducing subunit gp130.
One possible strategy could be the application of aptamers, small single-stranded nucleic acids with a defined three-dimensional structure that are able to bind target molecules with high affinity and specificity.
This thesis reports on the development of RNA aptamers with high affinity for the IL-6R. The use of an appropriate in vitro selection procedure, SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), enabled the isolation of six IL-6R specific ribonucleic acids (106 nt) displaying a characteristic G-rich consensus motif. One aptamer, 16-3, was further investigated using different methods like filter binding or gel shift assays. The affinity of aptamer 16-3 was in the range of other aptamer-receptor interactions with a dissociation constant in the low nanomolar range (Kd ~ 20 nM).
The specificity of the aptamer to its target was demonstrated using a variety of other proteins. In further experiments the aptamer could be shortened to 47 nt without loss of affinity, while a 19 nt long variant limited to the G-rich motif retained slight affinity. Further biochemical analyses, including filter binding assays using variants with base exchanges and the dependency on monovalent cations led to the assumption that the aptamer adopted a guanine quadruplex structure.
Aptamer 16-3 did not compete with the natural IL-6R ligands IL-6 and gp130, since 16 3 was still able to bind the soluble IL-6R (sIL-6R) in complex with these molecules. Interactions of the aptamer with Hyper-IL-6, a high biologically active IL 6/sIL 6R-fusion protein, alone or in complex with gp130 confirmed these observations.
Flow cytometry experiments demonstrated that the aptamers were able to recognize the native IL-6 receptor presented on the cell surface of murine Baf/3 cells that were stable transfected with human gp130 and IL-6R cDNAs. The ability of the aptamers to inhibit IL 6R activities in vivo still needs to be determined.
The data of this thesis demonstrate that Aptamer 16-3 binds to IL-6R in solution as well as on the cell surface thus allowing to access IL-6R presenting cells. These aptamers may help to optimize the design of useful tools blocking IL 6R functions and may pave the way for the development of novel therapeutic strategies against IL-6R related diseases. Furthermore it will have to be tested whether this aptamer may serve as highly specific carrier for further nucleic acids, peptides and/or toxins linked to the aptamer when possibly internalised in complex with the receptor.

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