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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-45037
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4503/


Identification of novel polysialic acid interacting partners and functional relevance of their interaction for peripheral nerve regeneration after injury in Mus musculus (Linnaeus, 1758).

Identifizierung neuer Interaktionspartner der Polysialinsäure und die funktionale Bedeutung dieser Interaktion für die Regeneration peripherer Nerven nach Verletzung in der Maus (Linnaeus, 1758).

Mishra, Bibhudatta

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Polysialinsäure , Histon , Regeneration , Marcks , peripheres Nervensystem
Freie Schlagwörter (Englisch): polysialic acid , histone , regeneration , Marcks , peripheral nervous system
Basisklassifikation: 42.13 , 42.63
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.01.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 25.02.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Nach traumatischer Verletzung peripherer Nerven entstehende Funktionseinbußen
werden bis heute unterschätzt und die Entwicklung neuer Therapien zur
Verbesserung der Regeneration und zur Unterstützung der Mikrochirurgie ist
dringend notwendig. In Nagetieren konnte gezeigt werden, dass polysialyliertes
NCAM nach einer Läsion in Axonen peripherer Motoneurone und in Schwann´schen
Zellen heraufreguliert wird. Basierend auf diesem Befund wird angenommen, dass
Polysialinsäure (PSA) durch Erhöhung der Synapsenbildung eine verbesserte
präferentielle Re-Innervierung (selektive „Zielerkennung“) von Motoneuronen
stimuliert.
PSA ist deshalb ein interessanter Kandidat für die Medikamentenentwicklung und
zum Einsatz zur Unterstützung der Reparatur von verletzten Nerven. Um die
positiven Effekte des PSA Kohlenhydrats für die Therapien von peripheren
Nervenverletzungen nutzbar zu machen, müssen die Bindunspartner dieses
Kohlenhydrats identifiziert werden, da das Kohlenhydrat selbst nicht für
therapeutische Anwendungen eingesetzt werden kann.
Es wurde gezeigt, dass PSA mit Molekülen der extrazellulären Matrix, wie Heparan-
Sulfat-Proteoglykanen, dem neurotrophischen Faktor BDNF und dem Hormon
Estradiol, interagiert. Es konnten unter Verwendung eines PSA mimikriernden „single
chain variable fragment“ (scFv) Antikörpers, der einen anti-idiotypischen Antikörper
gegen einen PSA-Antikörper darstellt, Histon H1 und das myristoylierte Alanin-reiche
C-Kinase Substrat (MARCKS) als neue potentielle PSA-Interaktionspartner
identifiziert werden. Die Untersuchung der Lokalisation dieser Moleküle in lebenden
und fixierten Zellen zeigte, dass Histon H1 und MARCKS mit PSA ko-lokalisiert
vorliegen. Mittels ELISA konnte zudem eine direkte Interaktion zwischen PSA und
Histon H1, aber nicht zwischen PSA und MARCKS nachgewiesen werden. Durch
Oberflächenbiotinylierung von Körnerzellen aus dem Cerebellum konnte zudem
nachgewiesen werden, dass Histon H1 auch extrazellulär lokalisiert vorkommt. Mit
Hilfe von Immunfärbungen von Körnerzellen und von Schwann´schen Zellen ließ sich
zeigen, dass extrazelluläres Histon H1 mit PSA im Extrazellularraum oder auf der
Zelloberfläche ko-lokalisiert. Immunfärbung hippokampaler Neurone zeigte weiterhin,
dass sowohl MARCKS als auch PSA teilweise auf der Zellmembran ko-lokalisiert
vorliegen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass extrazelluläres Histon H1 die
Bildung von Fortsätzen und die Proliferation von Schwann´schen Zellen, die Neuritogenese bei Körnerzellen und die Migration neuraler Stammzellen in vitro stark
fördert, und dass diese Prozesse PSA abhängig sind. Diese Resultate zeigen, dass
Histon H1 in der extrazellulären Matrix neuronaler Zellen vorliegt, wo es mit PSA
interagiert und für die Entwicklung des Nervensystems wichtige Prozesse wie
Neuritenwachstum, Zellmigration und Proliferation reguliert.
Um die Funktion von Histon H1 während der Regeneration des Nervensystems zu
untersuchen, wurde der Femuralis Nerv in adulten Mäusen läsioniert, und die
Regeneration in vivo untersucht. Applikation on Histon H1 verbesserte die
funktionelle Regeneration, das Wiederauswachsen von Axonen und die Präzision bei
der Reinnervation nach Verletzung des Femuralis Nervs. Diese Ergebnisse zeigen,
dass Histon H1 eine wichtige Rolle bei der Regeneration im peripheren
Nervensystem der Maus spielt.
In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass Histon H1 in der extrazellulären Matrix von
neuronalen Zellen vorkommt und dort spezifisch mit PSA interagiert um Migration
neuronaler Zellen, Proliferation und Auswachsen von Neuronen zu induzieren. Diese
Daten zeigen, dass der Interaktion zwischen Histon H1 und PSA während der
Entwicklung und der Regeneration des Nervensystems nach Verletzung eine
wichtige Funktion zukommt.
Kurzfassung auf Englisch: Traumatic peripheral nerve injuries are still underestimated and there is a major
requirement for new therapies improving functional recovery after injury and to
support microsurgery. In rodents, polysialylated NCAM (PSA-NCAM) was reported to
be up-regulated in peripheral motor axons and Schwann cells after lesion. Based on
this, it is hypothesized that polysialic acid (PSA) promotes preferential motor
reinnervation (selective targeting) by enhancement of synapse formation. This makes
PSA an interesting molecule for drug development and to support nerve repair. To
make the positive effects of the PSA carbohydrate available for therapy of peripheral
nerve injuries, potential binding partners of this carbohydrate have to be identified,
since the carbohydrate itself is not useful for therapeutic approaches.
PSA has been shown to interact with extracellular molecules like heparan sulphate
proteoglycans, the neurotrophic factor BDNF and the hormone estradiol. Histone H1
and myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS) have been identified as
potential binding partners of PSA using a PSA mimicking single chain variable
fragment (scFv) antibody which is an anti-idiotypic antibody against a PSA antibody.
Co-localization studies on live and fixed neuronal cells demonstrated that Histone H1
and MARCKS are co-expressed with PSA, although only a direct binding between
PSA and Histone H1, but not between PSA and MARCKS using ELISA could be
shown. Moreover, surface biotinylation of cerebellar granule cells confirmed the
extracellular localization of Histone H1. Live staining of cerebellar neurons and
Schwann cells confirmed that an extracellular pool of Histone H1 co-localizes with
PSA in the extracellular matrix or on the cell surface. Staining of fixed hippocampal
neurons showed that both MARCKS and PSA partially co-localize at the cell
membrane. Furthermore, extracellular Histone H1 strongly stimulated process
formation and proliferation of Schwann cells, neuritogenesis of cerebellar neurons
and migration of neural stem cells from neurospheres via a PSA dependent
mechanism in vitro. These results indicate that Histone H1 is present in the
extracellular matrix of neuronal cells, where it not only interacts with PSA but also
regulates neurite outgrowth, cell migration and proliferation which are crucial during
nervous system development. To evaluate the function of Histone H1 during regeneration of the nervous system, in
vivo femoral nerve lesion experiments were performed in adult mice. Application of
Histone H1 improved the functional recovery, axon regrowth and the precision of
reinnervation after femoral nerve injury, indicating that Histone H1 plays a functional
role during regeneration in the peripheral nervous system in mice.
These results indicate that Histone H1 is present in the extracellular matrix of neural
cells, where it interacts specifically with PSA and regulates neural cell migration and
proliferation as well as neurite outgrowth; pointing out that the interaction between
Histone H1 and PSA plays an important role during development and in regeneration
of the nervous system.

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