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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-45383
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4538/


Molekulare und funktionelle Auswirkungen einer adenoviralen Überexpression von short hairpin gegen Proteinkinase C alpha in neonatalen Rattenkardiomyozyten und rekonstituiertem Herzmuskelgewebe

Molecular and functional effects of adenoviral delivered short hairpin RNA targeting Proteinkinase C alpha in neonatal rat cardiomyocytes and reconstructed heart tissue

Singh, Jasmin Maya Annabel

Originalveröffentlichung: (2009) „Adenovirus-delivered short hairpin RNA targeting PKC alpha improves contractile function in reconstituted heart tissue”, Ali El-Armouche, Jasmin Singh, Hiroshi Naito, Katrin Wittköpper, Michael Didié, Wolfram-Hubertus Zimmermann, Thomas Eschenhagen Journal of Molecular and Cellular Cardiology 43 (2007) 371–376
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SWD-Schlagwörter: Herzinsuffizienz , RNS-Interferenz , Proteinkinase C
Freie Schlagwörter (Deutsch): rekonstituiertes Myokardium , sh-RNA , Proteinkinase C alpha
Basisklassifikation: 44.38
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 23.03.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die Herzinsuffizienz und ihre Komplikationen stellen eine der häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen dar. Trotz leitliniengerechter Pharmakotherapie liegt die 5-Jahres-Sterblichkeit noch immer bei etwa 50%. Die Suche nach neuen medikamentösen Angriffspunkten, gerade auch innerhalb der Kardiomyozyten selbst, ist daher heute ein Hauptgegenstand der Herz-Kreislaufforschung. Ein mögliches Arzneimittel-Target ist die zur Familie der Serin/Threoninkinasen gehörige Proteinkinase C alpha, die kürzlich als ein negativer Regulator der Kontraktionskraft identifiziert worden ist. Mittels transgener Technologie konnte gezeigt werden, dass das genetische Ausschalten der PKC alpha die bei der Herzinsuffizienz charakteristischerweise herabgesetzte Kontraktionskraft wiederherstellen kann. Da eine selektive pharmakologische Inhibition der PKC alpha derzeit noch nicht möglich ist, bietet sich der akute knockdown mittels RNA-Interferenz (RNAi) als vielversprechende Alternative an.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die prinzipielle Eignung eines RNAi-vermittelten spezifischen PKC alpha knockdown als potentiellen therapeutischen Ansatz zunächst auf zellulärer Ebene in isolierten Kardiomyozyten und rekonstituiertem Herzmuskelgewebe (EHT) zu untersuchen. Transfektion mit kurzen, chemisch synthetisierten siRNAs erwies sich in einer Serie von Experimenten als ungeeignet, da sich die Kardiomyozyten, wie viele andere post-mitotische Zellen, als nur unzureichend transfizierbar erwiesen. Um diese Limitation zu umgehen, wurde eine adenovirale Transduktionsmethode entwickelt. Hierzu wurde eine geeignete sh-RNA-Sequenz entworfen und in eine Expressionskassette unter der Kontrolle des menschlichen H1 RNA-Polymerase III-Promotors kloniert. Nach erfolgreicher Testung der knockdown-Effizienz der gegen PKC alpha-gerichteten sh-RNA und dem Vergleich mit einer nonsense-Sequenz als Negativkontrolle, wurden beide Expressionskassetten in ein adenovirales Expressionssystem eingefügt. Durch die bicistronische Coexpression von GFP konnte anhand der Epifluoreszenz mikroskopisch die Transduktionseffizienz in Kardiomyozyten beurteilt werden. Eine fluoreszenzmikroskopisch beobachtete Transduktionseffizienz von 100% ging mit einer 80%igen Herabregulation der PKC alpha auf mRNA-Ebene und einem 50%igen knockdown auf Proteinebene im Vergleich zur nonsense-Kontrolle einher. Zur funktionellen Analyse eines PKC alpha knockdowns wurden EHTs mit den entsprechenden Viren transduziert. Auch hier ließ sich eine nahezu vollständige Transduktionseffizienz mit einer Reduktion des PKC alpha-mRNA Gehaltes auf 60% beobachten. Diese Herabregulation ging mit einer gegenüber den mit dem Kontrollvirus transduzierten EHTs um 60% gesteigerten Kontraktionskraft einher. Dabei bestand eine signifikante negative Korrelation zwischen Kontraktilität und PKC alpha-mRNA-Gehalt in den EHTs. Diese Beobachtungen unterstreichen also einen kausalen Zusammenhang zwischen dem zellulärem PKC alpha-Gehalt und der Kontraktionskraft der jeweiligen Kardiomyozyten.
Zusammenfassend bestätigt diese Arbeit zum einen den Zusammenhang zwischen PKC alpha-Proteinmenge und der Kontraktionskraft des Herzens. Zum anderen spricht sie für die prinzipielle Eignung eines durch RNAi vermittelten Protein-knockdowns als viel versprechender gentherapeutischer Ansatz. Darüber sprechen die Daten dafür, dass die Kombination aus adenoviral vermittelter shRNA-Transduktion und dem EHT-Modell ein geeignetes Modell zur Target-Validierung ist.

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