Analysen zur Funktion des zellulären Transkriptionsfaktors Daxx im produktiven Replikationszyklus von Adenovirus Typ 5

Abstract

Das 55-kDa Genprodukt der frühen Region 1B (E1B-55K) von Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im produkti- ven Infektionszyklus von Ad5 einnimmt. Nach heutigem Wissensstand steuert E1B- 55K die virale Replikation in permissiven Wirtszellen auf allen Stufen der Genexpression. Den lytischen Aktivitäten des E1B-Proteins liegen unterschiedliche Wirkmechanismen zugrunde, die teilweise direkt mit seinen transformierenden onkogenen Eigenschaften gekoppelt sind. Im Mittelpunkt steht dabei die Inaktivierung des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 auf den Ebenen der Transkription und des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbaus. Als weitere Faktoren werden verschiedene Komponenten der PML-NB-Kerndomänen diskutiert, die an E1B-55K binden und eine wichtige Rolle in der DNA-Reparatur (Mre11 und DNA Ligase IV) und der Transkription (Daxx, PML und Sp100) spielen. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Rolle der PML-NB- Komponente Daxx im Ad5-vermittelten Transformationsvorgang primärer Säuger- zellen und im produktiven Infektionszyklus in permissiven Wirtszellen. Primäres Ziel war es, die Rolle der E1B-55K/Daxx-Interaktion in beiden Systemen mit Hilfe genetischer und biochemischer Analyseverfahren zu untersuchen. Dadurch sollte unter anderem die Bedeutung von Daxx bzw. der PML-NB-Kerndomänen in der Steuerung der viralen Onkogenese und im Ad5-Replikationszyklus aufgeklärt werden. Durch klassische Transformationsexperimente auf der Basis primärer Rattenepithel- zellen (pBRK) konnte gezeigt werden, dass die Bindung von E1B-55K an Daxx ein wichtiges Ereignis im Ad5-induzierten Transformationsvorgang in diesen Zellen darstellt. Interessanterweise wird dabei die Repression von p53 durch Mutationen in den Daxx-Bindemotiven nicht beeinträchtigt. Dieses Ergebnis bestätigt erstmals die Hypothese, dass das onkogene Potenzial von E1B-55K auch p53-unabhängige Funktionen umfasst, die über die Wechselwirkung und Inaktivierung von Daxx gesteuert werden. Außerdem unterstützen sie die Annahme, dass der Daxx- Interaktionspartner PML und möglicherweise andere PML-NB-Komponenten wichtige Zielproteine darstellen, über die E1B-55K zur vollständigen Zelltransformation beiträgt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Rolle der E1B-55K/Daxx-Interaktion im viralen Lebenszyklus untersucht. Mit Hilfe von Daxx-depletieren Tumorzelllinien (A549 und H1299) und pseudo-primären (HepaRG) knock-down Linien konnte gezeigt werden, dass Daxx ein negativer Regulator der Ad5-Replikation ist, der vermutlich auf transkriptioneller Ebene die Expression früher viraler Gene reprimiert. In diesem Zusammenhang gelang auch der Nachweis, das Daxx im zeitlichen Verlauf der lytischen Infektion dem proteasomalen Abbau über einen E1B-abhängigen Mechanismus zugeführt wird. Auf molekularer Ebene erfolgt die Reduktion von Daxx durch Cullin-5-gesteuerte Ubiquitinylierung an 26S-Proteasomen. Als eine weitere, wichtige Komponente des Abbaus konnte die SUMO-Konjugation des E1B-Proteins identifiziert werden. Insgesamt weisen diese Ergebnisse erstmalig auf eine E3-Ubiquitinligaseaktivität des E1B-Proteins hin, die vermutlich im Verbund mit anderen viralen Faktoren die Funktionen von Daxx in virusinfizierten Zellen moduliert. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um die viralen Faktoren E2A, L4-100K, pVI und pVII, das vermutlich zusammen mit Daxx den aktiven Transport des Ad5-Chromosoms in den Zellkern fördert.

We identified E1B-55K (early region 1B 55K protein) as an Ad5 protein interacting with Daxx. The death-associated protein Daxx found in PML-NBs (PML nuclear bodies) is involved in transcriptional regulation and cellular intrinsic antiviral resistence against incoming viruses. E1B-55K is a multifunctional phosphoprotein, promoting efficient viral replication via a number of different mechanisms. In the early phase of Ad5 infection E1B-55K protein counteracts antiproliferative processes induced by the host cell including activation of p53-dependent and independent apoptosis, induction of cell cycle arrest and stimulation of cellular DNA damage response. In the late phase E1B-55K controls efficient late viral protein production by stimulating the preferential cytoplasmic accumulation and translation of the viral late mRNAs. These multiple functions of E1B-55K require interaction with E4orf6 (early region 4 open reading frame 6). Recent work demonstrates that E4orf6 connects E1B-55K to a variety of cellular proteins termed cullin-5, Rbx1/RCO1/Hrt1, Elongin B and C to assemble a SCF-like E3-ubiquitin-ligase allowing the proteasomal degradation of interacting factors like p53, Mre11, DNA ligase IV and Integrin α3 subunit. We found that the viral protein E1B-55K binds to Daxx and induces its degradation through a proteasome-dependent pathway. We show that this process is independent of Ad E4orf6, known to promote the proteasomal degradation of cellular p53, Mre11, DNA Ligase IV and Integrin α3 in combination with E1B-55K. In this study we also demonstrate that Daxx represses Ad5 replication in infected non-transformed human hepatocytes (HepaRG) as well as in transformed human lung cells. Biochemical approaches determined enhanced total virus growth as well as synthesis of early viral proteins, viral mRNA and DNA in Daxx-depleted human cells. These data provide evidence for a major role of Daxx in an intrinsic defense mechanism of the host cell against Ad5. We observe that Daxx steady-state concentrations are antagonized by an E1B-55K-mediated proteasomal degradation via a cullin-5-dependent E3-ubiquitin-ligase late in Ad5 productive infection. These results illustrate the importance of the PML-NBs-associated factor Daxx in virus growth restriction and suggest that E1B-55K antagonizes innate antiviral activities of Daxx and PML-NBs to stimulate viral replication at a post-translational level.