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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-45994
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4599/


Molekulargenetische Untersuchungen zur Aufklärung der Dieback-Erkrankung von Dalbergia sissoo Roxb. in Bangladesch

Valdez Aguirre, Nayuf

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Basisklassifikation: 48.54 , 48.47 , 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mühlbach, Hans-Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.03.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 25.05.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die Dieback-Erkrankung von D.sissoo wird seit Jahrzehnten erforscht. Bei der Suche nach den Ursachen konzentrierten sich bisher zahlreiche Arbeiten auf Pilzinfektionen, aber es wurden auch Hinweise auf die Assoziation von phytopathogenen Bakterien der Gattungen Bacillus und Pseudomonas gegeben. In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe mikrobiologischer, phytopathologischer und molekularbiologischer Methoden die Beteiligung von Bakterien an der Dieback-Erkrankung untersucht und die Bakterien-Isolate charakterisiert werden.
Es konnte eine Methode etabliert werden, bei der Kontaminationsfaktoren gering gehalten und Bakterien mit langsamem Wachstum erfasst werden konnten. Ferner konnte festgestellt werden, dass die Lagerung des Pflanzenmaterials keinen starken Einfluss auf das Wachstum der Bakterien hatte. Dies ist wichtig für jede weitere Untersuchung, die nicht vor Ort stattfindet.
Die Gattungen der Isolate wurden molekularbiologisch mit Hilfe von universellen Primern für die 16S rDNA bestimmt. Der amplifizierte Bereich wurde ansequenziert und mit bekannten, in Datenbanken eingetragenen Bakterien verglichen. Es konnte ein breites Spektrum an Mikroflora in D. sissoo erfasst werden, wobei die Präsenz von Isolaten der Gattungen Pseudomonas und Pantoea besonders dominant waren. Dabei wurden Pseudomonas-Isolate ausschließlich bei Proben von symptomtragenden Bäumen gefunden.
Zur weiteren Charakterisierung der Pseudomonas- und Pantoea-Isolate wurden Gram-Färbungen, Oxidase- und Katalase-Tests durchgeführt. Zur Bestimmung des phytopathogenen Potenzials wurden im HR-Test verschiedene Modellpflanzen mit Bakteriensuspensionen der Isolate infiltriert. Die meisten der Pseudomonas- und Pantoea-Isolate waren HR-positiv. Für das Verständnis der Pathogenität der Isolate wurden Sekundärmetabolite mit Ethylacetat extrahiert und die Wirkung dieser Fraktionen auf Tabakblätter getestet. Da keines der Pantoea-Isolate eine positive HR-Reaktion im Ethylacetat-Extrakt zeigte, wurden keine weiteren Untersuchungen mit den Pantoea-Isolaten durchgeführt. Im Gegensatz hierzu konnte bei mindestens zwei Pseudomonas-Isolaten (1003 und 1004) eine pathogene Aktivität des Ethylacetat-Extraktes festgestellt werden. Eine chemische Charakterisierung des vermuteten Toxins wurde in der vorliegenden Arbeit nicht verfolgt.
Die molekulare Gruppierung der Pseudomonas-Isolate wurde mittels „Amplified-Fragment-Length-Polymorphism“ (AFLP) durchgeführt. Nach erfolgter AFLP-Analyse bildeten die meisten Pseudomonas-Isolate im Dendrogramm einen stabilen Cluster. Dieser zweigt, verglichen mit den verwendeten kommerziellen Stämmen (P. syringae, P. tremae, P. oleovorans, P. corrugata, P. cichorii, P. fluorescens und P. savastanoi) von diesen ab und gehört entweder einer hier nicht verwendeten oder einer bislang unbekannten Art an.
Populationsstudien innerhalb 14 erkrankter und vier symptomloser D. sissoo Bäume mittels denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) zeigten, dass sich charakteristische Banden der im AFLP-Versuch verwendeten Isolate in einen der beprobten Bäume wiederfanden. Es konnten zusätzlich zwei Banden detektiert werden, die in allen untersuchten Bäumen und Pflanzengeweben auch der scheinbar nicht Dieback-befallenen Kontrollen (K1-K4) vorkamen. Wenn davon ausgegangen wird, dass die Bäume nicht nur symptomlos, sondern auch gesund waren, könnte dies auf endophytische Bakterien hindeuten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal auch geprüft, ob in Proben von D. sissoo mit Dieback-Symptomen Phytoplasmen nachzuweisen sind. Hierfür wurden mehrere Primer-Kombinationen verwendet, die an verschiedenen Stellen im ribosomalen Operon binden. Es konnten in keinem der untersuchten Bäume Phytoplasmen nachgewiesen werden. Daher scheint es unwahrscheinlich, dass Phytoplasmen an der Dieback-Erkrankung von D. sissoo beteiligt sind.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit die Beteiligung von Bakterien der Gattung Pseudomonas an der Dieback-Erkrankung von D. sissoo in Bangladesch nachgewiesen werden. Es dürfte sich hierbei um eine nicht bekannte Art handeln.

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