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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-46029
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4602/


Interleukin-6-Rezeptor-spezifische DNA-Aptamere

Zivkovic, Tijana

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Interleukin-6 Rezeptor , Aptamere , G-Quadruplex
Freie Schlagwörter (Englisch): aptamer , G-quadruplex , Interleukin-6 receptor
Basisklassifikation: 35.71
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 12.05.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Das Interleukin-6 (IL-6) ist ein pleiotropes Zytokin, welches bei vielen biologischen Vorgängen, beispielsweise bei der Regulation von Immunantworten, Entzündungsreaktionen und der Hämatopoese, eine essentielle Rolle spielt. IL-6 stimuliert verschiedene Zielzellen über seinen Rezeptorkomplex bestehend aus zwei Rezeptoruntereinheiten, dem IL-6-Rezeptor (IL-6R) und dem Glykoprotein gp130. Eine Dysregulation der Zytokin-Produktion geht mit einer Vielzahl an Erkrankungen, z. B. der Rheumatoiden Arthritis, einher. Die Hemmung der IL-6-vermittelten Signaltransduktion stellt somit eine potentielle Anti-Zytokin-Therapie dar.
Eine zur Antikörper-Therapie alternative Strategie könnte die Anwendung von Aptameren bieten. Aptamere sind kurze einzelsträngige Nukleinsäuren, die ihre Zielmoleküle hoch affin und spezifisch binden. Deren vorteilhafte Eigenschaften Antikörpern gegenüber, prädestinieren sie für den Einsatz als Therapeutika.
Das Ziel dieser Arbeit lag in der Selektion von DNA-Aptameren mit Affinität für den löslichen IL-6R (sIL-6R), einer IL-6R-Variante ohne zytoplasmatischer und transmembraner-Domäne. In einem in vitro Evolutionsprozess (SELEX = Systematische Evolution von Liganden über EXponentielle Anreicherung) konnten fünf IL-6R-spezifische Aptamere isoliert werden (101 nt), die eine gemeinsame G-reiche Konsensussequenz aufwiesen. Zwei dieser Aptamere wurden in Filterbindungsstudien detailliert analysiert. Es konnten Dissoziationskonstanten zwischen 200 nM und 500 nM ermittelt werden. Aptamer-Varianten, die auf das G-reiche 16 bis 18 Nukleotid-lange Konsensusmotiv minimiert wurden, zeigten vergleichbare Affinitäten und Spezifitäten für sIL-6R. Die Aptamere interagierten mit keinem anderen getesteten Protein. Zur weiteren Verifizierung der Aptamer-Protein-Interaktionen wurden die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) sowie die Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) angewandt. Mit Hilfe beider Methoden konnte die Affinität der Aptamere zum Rezeptor bestätigt werden. Kompetitionsstudien führten zu dem Ergebnis, dass die Aptamere nicht mit den natürlichen IL-6R-Liganden, IL-6 und gp130, kompetieren. Das konservierte Bindemotiv wies eine vierfache Wiederholung der Basenabfolge GGGT auf. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Aptamere G-Quadruplexe als stabilisierende Strukturmotive ausbilden. Mutationsanalysen und CD-spektroskopische Aufnahmen bestätigten dies. Eine Bindung der DNA-Aptamere an den nativen Rezeptor, auf der Oberfläche IL-6R-tragender-Zellen, konnte durchflusszytometrisch nicht gezeigt werden. Ein Grund hierfür könnte die rasche Dissoziationsrate sein, die mittels SPR ermittelt wurde.
Zukünftig bleibt zu klären, ob die IL-6R-spezifischen Aptamere lediglich eine markierende Funktion besitzen oder aber Potenzial für eine in vivo Applikation haben, in dem sie beispielsweise die Wirkung des Rezeptors blockieren oder als Vehikel für eine Zelltyp-spezifische Aufnahme verschiedener therapeutischer Wirkstoffe, wie Toxine oder Nanopartikel, fungieren.
Kurzfassung auf Englisch: Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic cytokine which plays a pivotal role in immune responses, inflammation, and hematopoiesis. IL-6 acts on a variety of target cells via the ligand-binding receptor subunit IL-6R and the signal transducing subunit gp130. In various diseases, for example rheumatoid arthritis, elevated IL-6 levels were observed, promoting the progression and pathology of these diseases. The inhibition of the IL-6 signaling pathway seems to be a potential useful therapeutic strategy. One possible anti-antibody strategy could be the application of aptamers. Aptamers are short single-stranded nucleic acids with a defined three-dimensional shape, which allows them to bind target molecules with high affinity and specificity. This thesis reports on the development of DNA aptamers with affinity for the IL-6R. The use of an in vitro selection process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) enabled the isolation of five IL-6R specific aptamers (101 nt) featuring a common G-rich consensus motif. Two of them were analyzed in detail via filterbinding assays. The measured dissociation constants were in the range of 200 nM to 500 nM. Aptamer variants limited to the 16-18 nt long G-rich motif showed the same affinity and specificity. Additionally, aptamer-protein interactions were verified by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and surface plasmon resonance (SPR). The aptamers did not compete with the natural IL-6R ligands IL-6 and gp130. The characteristic GGGT repeats in the conserved motif led to the assumption that stable G-quadruplex structures were formed. Mutation analysis and CD-spectroscopy confirmed this. Flow cytometry experiments revealed no binding of aptamers to cells carrying the IL-6 receptor on their surface. In the future it remains to be determined, whether the IL-6R specific aptamers could be used as a novel therapeutic tool blocking IL-6R functions or drug-delivery vehicles in in vivo applications.

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