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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-46114
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4611/


Regulation des BK-Kanals durch die Proteinkinase C

Utku, Emine

Originalveröffentlichung: (2009) Zhou X-B., Wulfsen I, Lutz S, Utku E, Sausbier U, Ruth P, Wieland T and Korth M (2008) M2 muscarinic receptors induce airway smooth muscle activation via a dual, Gâã-mediated inhibition of large conductance Ca2+-activated K+ channel activity. J. Biol. Chem. 283, 21036-21044
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SWD-Schlagwörter: Proteinkinase C , BK-Kanal , Patch-Clamp-Methode , Muskelkontraktion
Basisklassifikation: 44.33
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 26.05.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation des BK-Kanals durch die PKC mit der Patch-Clamp-Technik elektrophysiologisch untersucht. Dazu wurden HEK293-Zellen transient mit der cDNA des BKA-Kanals transfiziert und native Zellen aus der Maustrachea verwendet. Aus den Untersuchungen ergaben sich folgende Schlussfolgerungen:

1. Sowohl in HEK293-Zellen als auch in nativen Zellen wird die Offenwahrscheinlichkeit (NPo) des BK-Kanals durch die PKC reduziert ohne die Einzelkanalleitfähigkeit zu beeinflussen.
2. Mittels zielgerichteter Mutagenese, bei denen alle putativen
PKC-Phosphorylierungsstellen so verändert wurden, dass eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr möglich war, konnten zwei für die PKC-Regulation essentielle Serine (Ser695 und Ser1151) identifiziert werden.
3. Für die PKC-induzierte Hemmung ist das Ser695 verantwortlich. Dieses Ser695 befindet sich in dem "Linker" zwischen den beiden
RCK-Domänen (RCK1 und RCK2, regulators of conductance of
K+-channles), die einen entscheidenden Einfluss auf den Öffnungsmechanismus des BK-Kanals haben. Die Phosphorylierung von Ser695 ist dabei konditional und abhängig von der Phosphorylierung von Ser1151.
4. Ser1151 hat neben der PKC-Regulation auch Einfluss auf die PKA- und PKG-Regulation des BK-Kanals. Wenn Ser1151 phosphoryliert vorliegt (konstitutiv), ist eine Aktivierung durch die PKG möglich. Durch Dephosphorylierung des Ser1151 kann eine Aktivierung durch die PKA erfolgen. Sind beide Serine (Ser695 und Ser1151) phosphoryliert wird eine PKG- und PKA-Aktivierung verhindert.
5. Die Phosphorylierung einer einzigen alpha-Untereinheit des tetrameren BK-Kanals reicht aus, um eine Hemmung des Kanals durch die PKC zu induzieren.
6. BK-Kanäle in glatten Muskelzellen aus der Maustrachea verhalten sich in ihrer Regulation durch die PKC vergleichbar wie BK-Kanäle in HEK293-Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die Stimulation des Muskarinrezeptor-Subtyp M2 (M2R) durch den Muskarinrezeptor-Agonisten Carbachol (CCh) die Aktivität von BK-Kanälen hemmt. Nähere Untersuchungen zeigten, dass die PKC für die CCh-induzierte Hemmung verantwortlich ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der BK-Kanal mit der PKC und der Proteinphosphatase 1 (PP1) assoziiert, die über ein Wechselspiel von PKC und PP1 den Kanal regulieren. Diese Beobachtung widerlegt Theorien, die eine indirekte Regulation des BK-Kanals durch Proteinkinasen vermuten.

In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die PKC-Regulation des BK-Kanals über zwei Phosphorylierungsschritte (Ser695 und Ser1151) erfolgt. Die beiden Serine sind zudem nicht nur für die PKC-induzierte Hemmung des BK-Kanals verantwortlich, sondern auch für die Aktivierung des BK-Kanals durch die PKG und PKA. Diese kooperative Regulation des BK-Kanals durch die PKC, PKG und PKA erlaubt die Aktivierung oder Hemmung des Kanals durch die entsprechenden Proteinkinasen und verdeutlicht seine Wichtigkeit bei der Kontraktion der glatten Muskulatur, wodurch eine Kontraktion gefördert oder beendet werden kann.

Kurzfassung auf Englisch: Large conductance, voltage- and Ca2+-activated potassium channels
(BK channels) are important regulators in excitable cells and are potently regulated by protein kinases. Protein kinases such as PKG, PKA and PKC can modulate BK channels. Whereas PKG- and PKA-induced channel activation in smooth muscle has been extensively studied, the molecular mechanism of BK channel inhibition by PKC is unknown. We have used the patch-clamp technique to investigate the regulation of BK channels by PKC in HEK293 cells and in cell-free patches of native smooth muscle cells. We show that PKC inhibits BK channel open state probability by phosphorylation of Ser695. This Ser695 is located in the linker between the two regulators of K+ conductance domains (RCK1 and RCK2). Phosphorylation of Ser695 is conditional, depending on the unconditional phosphorylation of Ser1151 which is part of a tandem PKC motif at the C-terminal end. We demonstrate that phosphorylation of Ser1151 switches channel activation from PKA to PKG, whereas conditional phosphorylation of Ser695 renders the BK channel insensitive to either PKG or PKA. In addition, inhibition of BK channels by PKC depends on phosphorylation of only a single alpha-subunit in the channel tetramer at Ser1151 and Ser695. In native smooth muscle cells the regulation of BK channel activity by PKC is identical to that observed at the recombinant channels expressed in HEK293 cells. In addition, protein phosphatase 1 inhibitor peptide (PPI2) mimic the effects of PKC, thereby disproving the concept of an indirect regulation of BK channels by protein kinases via phosphatases. Accordingly, the phosphorylation state of Ser695 depends on the balance between PKC and protein phosphatase 1 (PP1), which are associated with BK channels.
Thus, unconditional and conditional phosphorylation by PKC provides smooth muscle cells with a powerful mechanism to render BK channels sensitive or insensitive to PKG or PKA, and to support smooth muscle contraction by blunting the negative feedback mechanism of BK channels.

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