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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-46470
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4647/


Das Integrations- und Differenzierungspotential von neuralen Stammzellen im embryonalen Nervensystem: Xenotransplantation von murinen neuralen Stammzellen in das Nervensystem von Hühnchenembryonen

Mayr, Marion Christiane

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Basisklassifikation: 44.49
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bartsch, Udo (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2010
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 21.06.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Neurale Stammzellen verfügen als gewebespezifische Stammzellen über das Potential, in die verschiedenen neuralen Zelltypen zu differenzieren. In der vorliegenden Arbeit wurden neurale Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem EGFP-transgener Mausembryonen in Gegenwart der Wachstumsfaktoren EGF und FGF-2 als frei schwimmende, sogenannte Neurosphären kultiviert. Die unter diesen Bedingungen expandierten neuralen Stammzellen ließen sich in vitro sowohl in neuronale als auch in gliale Zelltypen differenzieren, die mittels immunzytochemischer Untersuchungen mit Zelltyp-spezifischen Antikörpern identifiziert wurden. Die Mehrzahl der neuralen Stammzellen differenzierte in GFAP-positive Astrozyten. Ein Anteil differenzierte in reife Oligodendrozyten, die über ihre MAG- und MBP-Expression identifiziert wurden. Schließlich konnte auch ein Teil der Zellen als ß-Tubulin Typ III-positive Nervenzellen identifiziert werden. Anhand von Transplantationsexperimenten mit Hühnchenembryonen wurde das Integrations- und Differenzierungspotential der murinen neuralen Stammzellen in vivo untersucht. Dazu wurde eine Transplantationsmethode etabliert, die eine Transplantation von Zellen in das zentrale Nervensystem von Hühnchenembryonen in ovo erlaubt. Dazu wurden die in vitro expandierten neuralen Stammzellen in die Hirnbläschen von 5 bis 7 Tage alten Hühnchenembryonen transplantiert und nach 7 bis 14 Tagen mittels Immunhistochemie und in situ Hybridisierung auf ihr Integrationspotential und Differenzierungsverhalten in den Hühnchengehirnen untersucht. Die Spenderzellen wurden dabei in den Empfängergehirnen aufgrund ihrer Expression des Reportergens EGFP identifiziert und von endogenen Zelltypen unterschieden. Insgesamt zeigte die Analyse des Integrationsverhaltens, dass die murinen neuralen Stammzellen nach intraventrikulärer Transplantation über das Ependym in das Hirnparenchym der Empfängertiere einwanderten, ohne dabei die Entwicklung des embryonalen Nervengewebes sichtbar zu beeinträchtigen. Im Hirnparenchym der Empfängertiere wanderten die transplantierten Zellen teilweise über beachtliche Strecken und differenzierten in morphologisch komplexe Zelltypen mit fein verzweigten Zellfortsätzen, die scheinbar in Kontakt zu den Blutgefäßen oder zu endogenen Zellen der Empfängergewebe standen. Die Analyse des Differenzierungspotentials der Spenderzellen in vivo erfolgte mittels immunhistochemischer Doppelfärbungen mit EGFP- und Zelltyp-spezifischen Antikörpern sowie mittels in situ Hybridisierungen mit Spezies-spezifischen Riboproben zum Nachweis Zelltyp-spezifischer Transkripte. In diesen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die murinen neuralen Stammzellen in den Gehirnen der Hühnchenembryonen in sämtliche neurale Zelltypen des zentralen Nervensystems –Astrozyten, Oligodendrozyten und Nervenzellen – differenziert waren. Über ihre Expression von GFAP konnten einige der Zellen als morphologisch und möglicherweise auch funktionell intakte Astrozyten identifiziert werden. Diese Astrozyten wiesen zahlreiche reich verästelte Fortsätze auf, von denen einige in engem Kontakt zu Blutgefäßen des Empfängergewebes standen. Ebenso fanden sich in den Hühnchengehirnen terminal differenzierte, MBP- und PLP-exprimierende murine Oligodendrozyten. Neben terminal differenzierten Oligodendrozyten wurden auch unreife Oligodendrozytenvorläuferzellen über ihre PDGFR alpha-Expression detektiert. Die Spender-Oligodendrozyten waren präferentiell in Regionen myelinisierter Fasertrakte nachweisbar, in denen auch endogene Oligodendrozyten lokalisiert waren. Einige dieser Spender-Oligodendrozyten waren offenbar auch in der Lage, mit den Axonen der Hühnchenembryonen zu interagieren und diese zu myelinisieren. Über ihre ß-Tubulin Typ III-Expression konnten einige, vorzugsweise in der grauen Substanz der Empfängergehirne liegende, Spenderzellen als Neurone identifiziert werden. Diese Spender-Nervenzellen wiesen fein verzweigte Fortsätze auf, die in das Hirnparenchym projizierten und über die die Spenderzellen mit anderen Zellen in Verbindung zu stehen schienen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass murine neurale Stammzellen nach intraventrikulärer Transplantation in das embryonale und noch neurogene Nervensystem von Hünchenembryonen durch das Ependym in das Parenchym der Empfängergehirne integrieren, ohne dabei die Histoarchitektur der Empfängergehirne nachweislich zu beeinträchtigen. Die transplantierten murinen neuralen Stammzellen differenzierten in morphologisch intakte neurale Zelltypen, die über ihr Antigenprofil als Astrozyten, Oligodendrozyten und Nervenzellen identifiziert werden konnten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die hier aufgebaute in ovo Transplantationsmethode aufgrund des noch nicht entwickelten Immunsystems der Hühnchenembryonen die Möglichkeit bietet, das Integrations- und Differenzierungspotential von Stammzellpopulationen verschiedener Spezies effizient in vivo zu analysieren.

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