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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47065
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4706/


Molekulare Korrelate repolarisierender K-Ströme in Mäusemyozyten und ihre pathophysiologische Umstrukturierung

Molecular correlates of repolarising K-currents in murine myocytes and their pathophysiological remodeling

Szlachta, Kamila

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Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dartsch, Dorothee (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 23.07.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In erregbaren Membranen kontrollieren spannungsgesteuerte K+ (Kv)-Kanäle die Entstehung und den zeitlichen Verlauf von Aktionspotentialen. Dabei spielen schnell aktivierende und inaktivierende A-Typ-Kanäle der Kv4-Unterfamilie eine wichtige Rolle. Im Herzen vermitteln sie die schnelle Komponente eines transienten Auswärtsstroms (Ito). Native Kv4-Kanalkom-plexe setzen sich aus Kv4-Alpha-Untereinheiten und akzessorischen Beta-Untereinheiten, den Kv-Kanal-Interagierenden Proteinen (KChIPs) und den Dipeptidyl-Aminopeptidase-verwandten Proteinen (DPPs) zusammen. Diese Beta-Untereinheiten sind in der Lage die elektrophysiologischen Eigenschaften und die funktionelle Oberflächenexpression von Kv4-Kanälen zu modifizieren. In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Kontrollmechanismen nativer Kv4-vermittelter A-Typ-Ströme in ventrikulären Mäusemyozyten unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen untersucht werden.
Basierend auf früheren Interaktionsstudien von Kv4.2 und KChIP2 sollte ein Kv4.2A14K Knock-in Mausmodell für eine KChIP2-Bindungsdefizienz generiert werden. Ein derartiges Mausmodell erlaubt die Untersuchung einer Interaktion in vivo, ohne Überexpressions-artefakte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Targetingvektor für das Knock-in Mausmodell erstellt, das zukünftig in embryonale Stammzellen eingebracht werden kann. Die molekularen Determinanten einer Interaktion von Kv4.2 und DPP konnten nicht endgültig aufgeklärt werden. Es wurde eine Mutation gefunden (Kv4.2A249F), bei der die Potentierung der Stromdichte durch DPP stark vermindert war. Diese Aminosäureposition könnte bei der Interaktion eine Rolle spielen.
Ein erfolgreiches Hypertrophiemodell wurde mittels 14-tägiger Angiotensin II Behandlung induziert. In hypertrophierten Kardiomyozyten des linken Epikards war, im Gegensatz zu früherern Befunden in anderen Modellen, die Ito-Amplitude im Vergleich zur Kontrolle nicht niedriger. Während die Proteinexpression von Kv4.2 und KChIP2 in diesem Zusammenhang ebenfalls nicht niedriger war, wurde eine geringere mRNA-Expression von Kv4.2 bei unveränderter KChIP2 mRNA-Expression beobachtet. Diese Ergebnisse legen eine Regulation der physiologischen Ito-Dichte in kardialen Mäusemyozyten durch KChIP2 nahe. Diese These wurde durch die geringe Ito-Dichte in KChIP2-Knockout Mäusen bekräftigt. Allerdings scheint KChIP2 für die Ausbildung von funktionellem Ito nicht essentiell zu sein.
Weiterhin sollte eine mögliche Modulation des Kv4.2-vermittelten Ito in murinen Kardio-myozyten durch die in Hundemyozyten als Ito-Aktivator charakterisierte Substanz NS5806 untersucht werden. In linksventrikulären Mäusemyozyten bewirkte NS5806 eine Reduktion der Gesamtkaliumstrom-Amplitude und führte zu keiner Potentierung der Ito-Amplitude. Die Kinetik der Ito-Inaktivierung sowie der Erholung von der Inaktivierung wurden durch NS5806 stark modifiziert. Allerdings waren die Effekte von NS5806 auf den Ito und weitere Stromkomponenten sehr heterogen und sind daher mit äußerster Vorsicht zu bewerten.
Kurzfassung auf Englisch: In excitable membranes the generation and the time course of action potentials are controlled by voltage-dependent K+ (Kv) channels. In this process rapidly activating and inactivating A-type potassium channels belonging to the Kv4 subfamily play a central role. In the heart they mediate the fast component of a transient outward current (Ito). Native Kv4-channel-complexes consist of Kv4-Alpha-subunits and accessory Beta-subunits, Kv-channel-interacting proteins (KChIPs) and the dipetidyl-aminopeptidase-related proteins (DPPs). These Beta-subunits are able to modify the electrophysiological properties and the functional surface expression of Kv4-chanels. In this thesis the molecular control mechanism of native Kv4-mediated A-type-currents in murine ventricular myocytes under physiological and pathophysiological conditions were investigated.
Based on former interaction studies of Kv4.2 and KChIP2 a Kv4.2A14K knock-in mouse model for a loss of KChIP2 binding should be generated. Such a model permits the investigation of an interaction in vivo and without artefacts of protein overexpression. The targeting vector for the knock-in model was cloned in this work. In the future it can be introduced into embryonic stem cells. The molecular determinants of an interacting between Kv4.2 and DPP could not be clarified. One mutation was found (Kv4.2A249F), in which the potentiation of the current-density by DPP was strongly reduced. This amino acid may play a role in the interaction.
A successful hypertrophy model was induced via 14 days of Angiotensin II treatment. In hypertrophied cardiomyocytes of the left epicard the Ito-amplitude was not diminished, contrary to what is described for other models. While the protein expression of Kv.2 and KChIP2 was not diminished as well in this context, a lower mRNA-expression of Kv4.2 together with an unchanged KChIP2 mRNA-expression were observed. These results suggest that the physiological Ito-density in cardiac myocytes of mice is regulated by KChIP2. This assumption corroborated by a low Ito-density in KChIP2-Knockout mice. However, KChIP2 seems to be not absolutely essential for the generation of functional Ito.
A possible modulation of the Kv4.2-mediated Ito should be analysed in murine cardiomyocytes by the substance NS5806, which was characterized as an Ito-activator in canine myocytes. In left ventricular myocytes NS5806 caused a reduction of the K+-current-amplitude but did not cause a potentiation of the Ito-amplitude. The kinetics of inactivation and recovery were strongly modified by NS5806.
However, the effects of NS5806 on the Ito and other current components were very heterogeneous and have to be interpreted with great caution.

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