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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47328
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4732/


Lipoprotein- und Apolipoprotein E-Stoffwechsel in humanen Adipozyten

Lipoprotein and apolipoprotein E metabolism in human adipocytes

Lasrich, Dorothee

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SWD-Schlagwörter: Lipidstoffwechsel , Apolipoprotein E
Freie Schlagwörter (Englisch): humane Adipozyten
Basisklassifikation: 42.10 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Beisiegel, Ulrike (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.01.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 30.08.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Das Fettgewebe nimmt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel ein, da aufgenommene Fettsäuren zum Einen in Form von Triglyzeriden gespeichert, zum Anderen in katabolen Stoffwechsellagen zur Energiegewinnung freigesetzt werden. Im Plasma werden Fettsäuren in Form von komplexen Triglyzerid-reichen Lipoproteinen transportiert. Das in mit diesen Lipoproteinen assoziierte Apolipoprotein E (ApoE) wird in hohen Konzentrationen auch von Adipozyten synthetisiert. Die Bedeutung dieses regulatorisch wichtigen Apolipoproteins für das Fettgewebe war zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit was es daher, die ApoE-abhängige Aufnahme und Sekretion von Lipoproteinen in humanen Adipozyten, und somit die Bedeutung des ApoE für den Lipoprotein- und Energiestoffwechsel des Adipozyten zu untersuchen.
Dafür wurde ein humanes Adipozytenmodell verwendet, welches durch Differenzierung aus immortalisierten mesenchymalen Stammzellen generiert werden kann. Nach erfolgreicher Charakterisierung des verwendeten Zellsystems hinsichtlich der induzierten Expression adipozytärer Markergene auf mRNA-Ebene mittels quantitativer Real time PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot-Analytik und ELISA, konnte eine deutlich erhöhte Expression ebenfalls für ApoE, die Lipoprotein Lipase sowie für die Lipoproteinrezeptoren VLDL-R, LDL-R und LRP1 in den differenzierten Adipozyten nachgewiesen werden. Trotz der hohen Expression dieser regulatorisch wichtigen Proteine wurde mit Hilfe von radioaktiv- und fluoreszenzmarkierten Lipoproteinen gezeigt, dass die ApoE-abhängige Aufnahme von Lipoproteinen in Adipozyten nur zu einem sehr geringen Anteil erfolgt.
Die ApoE-Sekretion der humanen Adipozyten erfolgt in einer nicht-lipidierten Form, was durch Gelfiltrations-Analysen der Zellkulturüberstände der differenzierten Zellen gezeigt werden konnte. Dabei wird das ApoE über einen konstitutiven Mechanismus sezerniert, der abhängig von der intrazellulären Proteinkinase A-Aktivität und Calcium-Signalkaskaden verläuft. ApoE wird demzufolge in hoher Konzentration von Adipozyten synthetisiert und sezerniert, wobei diese Prozesse weder die Lipoproteinaufnahme noch die Lipidfreisetzung maßgeblich beeinflussen. Mittels einer stabilen, lentiviral-vermittelten siRNA-Expression gegen ApoE sowie durch die Überexpression der humanen ApoE3-Isoform in den hMSC-Tert Adipozyten, konnte jedoch eine zentrale Bedeutung des endogenen ApoE für die Differenzierung der Adipozyten gezeigt werden. Die ApoE-depletierten Zellen zeigen im Vergleich zu entsprechenden Kontrollzellen eine stark verringerte Triglyzerid-Akkumulation, was auf einer beeinträchtigten Differenzierung der Zellen beruht. Die Supplementation von exogen zugeführtem humanem ApoE3 während der Differenzierung führte zwar zu einer gesteigerten Akkumulation von Triglyzeriden, aber nicht zu einer Rekonstitution der Differenzierung hinsichtlich der Expression adipozytärer Markergene.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen folglich, dass der Lipidstoffwechsel humaner Adipozyten nur zu einem geringen Anteil durch die Aufnahme und Sekretion von Lipoproteinen beeinflusst wird. Dessen ungeachtet ist das in Adipozyten synthetisierte ApoE an der Regulation der adipozytären Differenzierung maßgeblich beteiligt, wobei die genaue Funktion von ApoE in diesem physiologisch und pathophysiologisch wichtigen Prozess noch nicht abschließend geklärt werden konnte.
Kurzfassung auf Englisch: Adipose tissue plays a key role in energy metabolism. In plasma, fatty acids are transported in triglyceride-rich lipoproteins. The lipoprotein-associated apolipoprotein E (apoE) is in high concentrations also synthesized in adipocytes. The aim of this thesis was to investigate the apoE-dependent uptake and secretion of lipoproteins in human adipocytes, and therefore its role for the lipoprotein- and energy metabolism in adipocytes.
To address this questions a human adipocyte model was used, which could be differentiated from human mesenchymal stem cells. After characterization of these cells, in comparison to human primary adipocytes, in regard to adipocyte marker expression on mRNA level with qRT-PCR and on protein level using western blot analysis and ELISA, an upregulated expression for apoE, lipoprotein lipase, as well as the lipoprotein-receptors LDLR and LRP1 in differentiated adipocytes could be shown. Despite the upregulation of this regulatory important proteins, by using radioactive and fluorescence-labeled lipoproteins, it could be shown that there is only little apoE-dependent uptake of lipoproteins into adipocytes. ApoE is secreted by adipocytes in a lipid-free form, which could be shown using gelfiltration assays of cell culture supernatants of differentiated adipocytes. ApoE is secreted via a constitutive pathway which is denpendent on intracellular proteinkinase A and calcium-signaling. Adipocytes synthesize and secrete apoE in high concentrations, at which lipoprotein uptake and lipid release are not relevantly affected. A stable lentiviral-siRNA-knockdown against apoE, as well as overexpression of the human apoE3-isoform in hMSC-Tert adipocytes, was used to prove a central role for the endogenous apoE in adipocyte differentiation. The apoE-depleted cells show a drastically decreased triglyceride accumulation due to an impaired adipogenic differentiation. Supplementation experiments with exogenous human apoE led to a slightly increased triglyceride accumulation, but could not restore adipogenic differentiation in regard to adipocyte marker gene expression.
Therefore the results of this thesis show, that the lipid metabolism of human adipocytes is only little affected by uptake and secretion of lipoproteins. Nevertheless, the endogenous adipocyte apoE is relevant for adipogenic differentiation, whereas the exact role of apoE in this physiological and also pathophysiological important process remains unclear.

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