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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47417
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4741/


Beschleunigte und sichere Isolierung und Expansion humaner mesenchymaler Stromazellen in Tierserum-freiem Medium für die Transplantation und regenerative Medizin

Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine

Cakiroglu, Figen

Originalveröffentlichung: (2009) Journal of Cellular Physiologie 213: 18-26, 2007; Cellular Therapy and Transplantation (CTT), Vol. 1, No. 2, 1 December 2008
pdf-Format:
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Basisklassifikation: 44.86
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Zander, Axel Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2010
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 25.10.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Mesenchymale Stromazellen (MSZ) wurden 1966 zum ersten Mal durch Friedenstein et al. beschrieben. Seitdem sind sie von erheblichem Interesse und eine große Anzahl von Studien wurde durchgeführt, um Funktion und Nutzen dieser Zellen in vitro und in vivo zu ergründen (Pittenger et al., 1999; Deans and Mosley, 2000; Fibbe and Noort, 2003). Es konnte in präklinischen (Kopen et al., 1999; Mahmood and Chopp, 2004; Petite et al., 2000; Lange et al., 2005B; Tögel et al., 2005; Jaquet et al., 2005) und klinischen (Horwitz et al., 1999; Le Blanc et al., 2004; Koc et al., 2000; Koc et al., 2002; Chen et al., 2004) Studien über neuronale Regeneration nach Degeneration, Osteogenesis imperfecta, Spender-gegen-Wirt-Krankheit, metabolische Erkrankungen, Knochen- und Knorpelkrankheiten sowie über Nieren- und Myokardinfarkt gezeigt werden, dass MSZ ein beträchtliches therapeutisches Potential besitzen. Bis heute gehört zur etablierten Methode für die Expansion und Differenzierung von hMSZ die Nutzung von fötalem Kälberserum (FKS). Dieses Serum kann allerdings eine unerwünschte Quelle für xenogene Antigene sein und birgt die Gefahr der Kontamination mit tierischen Viren und Prionen sowie der Zoonose in sich. Der Kontakt mit tierischem Eiweiß kann außerdem anaphylaktische Reaktionen und lokale Entzündungen auslösen und zur Abstoßung der transplantierten Stammzellen führen (Selvaggi et al., 1997; Mackensen et al., 2000; Tuschong et al., 2002). Nach zellulärer Kardioplasie konnten sogar Arrhythmien festgestellt werden (Chachques et al., 2004). Obwohl FKS durch sequentielle Kultivierung von MSZ zuerst in FKS, darauf folgend in autologem oder heterologem Serum (Spees et al., 2004) bis zu 99,99% eliminiert werden kann, verbleibt ein gewisses Restrisiko. Deshalb wird aktiv nach Alternativen gesucht. Um hMSZ für die klinische Anwendung nutzen zu können, gab es bisher mehrere Versuche, diese Zellen in FKS-freien Medien zu kultivieren, indem z.B. statt FKS humanes Serum zum Einsatz kam. In autologem Serum zeigte sich zumindest in den ersten Passagen im Vergleich zu FKS eine schnellere Proliferation ohne Verlust der typischen Eigenschaften des Phänotyps, der Beweglichkeit und der Differenzierungsfähigkeit in vitro, wo hingegen in allogenem humanem Serum Wachstumsstillstand und Absterben der Zellen resultierten (Shahdadfar et al., 2005; Mizuno et al., 2006; Stute et al., 2004). Yamaguchi et al. (2002) beobachteten eine bessere Expansion unter dem Zusatz von humanem AB-Serum oder autologem Serum bzw. Plasma, allerdings nur unter der zusätzlichen Gabe von Wachstumsfaktoren (bFGF-basic Fibroblast Growth Factor). Autologes oder allogenes Serum kann aber bisher nicht als gängiger Ersatz für FKS zur Anwendung kommen, da es nicht möglich ist, es in der benötigten Menge zu gewinnen.Außerdem gibt es bis jetzt nur wenige nach GMP-produzierte Wachstumsfaktoren, von denen die meisten nicht von Nutzen sind. Ergebnisse der letzten Zeit zeigen, dass humane Thrombozytenkonzentrate als ein sicherer Ersatz des tierischen Serums für die Expansion von hMSZ Verwendung finden können (Yamada et al., 2004; Doucet et al., 2005; Müller et al., 2006). Die daraus resultierenden hMSZ sind allerdings noch nicht vollständig charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Bedingungen für eine Serum-freie Kultivierung von hMSZ intensiv untersucht. Dabei kam Plättchenlysat (PL) als Ersatz für und im Vergleich zu FKS zur Anwendung. Von besonderem Interesse waren dabei das Wachstums- und Differenzierungsverhalten der unter diesen Bedingungen kultivierten Zellen. Die Ergebnisse wurden zusammengetragen und einander gegenübergestellt.
Kurzfassung auf Englisch: Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC), also named mesenchymal stem cells, are characterized by plastic adherence to plastic when maintained in standard cultures in vitro, by expression of surface antigens CD105 and CD90 but lack of hematopoietic markers CD34 and CD45 and by differentiation into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro(Dominici et al., 2006). Since their first description by Friedenstein et al. (Friedenstein et al.,1974), a multitude of work has been carried out to show their properties and functionality in vitro and in vivo (Pittenger et al., 1999; Deans and Mosley, 2000; Fibbe and Noort, 2003).
MSC have been shown to display a considerable therapeutic potential in pre-clinical (Koppen et al., 1999; Mahmood and Chopp, 2004; Petite et al., 2000; Lange et al., 2005B; Tögel et al., 2005; Jaquet et al., 2005) and clinical (Horwitz et al., 1999; Le Blanc et al., 2004; Koc et al.,
2000; Koc et al., 2002; Chen et al., 2004) studies for the treatment/regeneration of neuronal degeneration, osteogenesis imperfecta, graft-versus-host disease, support of hematopoietic engraftment, metabolic diseases, bone and cartilage tissues as well as renal and myocardial infarction. To date, all reported clinical trials are employing hMSC generated in medium supplemented with fetal calf serum (FCS). FCS, however, is an undesired source of
xenogeneic antigens and bears the risk of transmitting animal viral, prion and zoonose contaminations. Additionally, FCS has been implicated with anaphylactic or arthus-like immune reactions in patients who received cells generated in FCS-supplemented medium (Selvaggi et al. , 1997), even leading to arrhythmias after cellular cardioplasty (Chachques et al., 2004). Uptake of FCS components is an active process (Gregory et al., 2006). Although FCS can be removed up to 99.99% by sequential cultivation of MSC first in FCS, followed by autologous or heterologous serum (Spees et al., 2004), a residual risk still remains. Several attempts have been made to omit FCS from cultures of hMSC for clinical applications and
replace it by autologous or heterologous serum or plasma. In autologous serum, hMSC show faster proliferation compared to FCS at least during first passages without loss of the typicalphenotype, motility and differentiation capabilities in vitro, whereas use of allogeneic human
serum resulted in hMSC growth arrest and death (Shahda dfar et al., 2005; Mizuno et al., 2006; Kobayashi et al., 2005; Stute et al., 2004). Thus, autologous or allogeneic serum cannot be considered as a general substitute for FCS. Another attempt was made by using serum-free medium supplemented with a serum substitute that allowed better expansion than classical alpha-MEM medium (Meuleman et al., 2006), however expansion of MSC is still unsatisfactory.
Very recently, human platelet lysates have been shown to serve as a safe substitute for animal serum for hMSC expansion (Yamada et al., 2004; Doucet et al., 2005; Müller et al., 2006), but the resulting hMSC are still not fully characterized. In this study, we have extensively analyzed animal-serum free culture conditions for hMSC expansion using platelet lysate as a substitute for FCS. Compared to FCS-supplemented culture conditions, we found a significant
increase of both CFU-F as well as cumulative cell numbers after expansion. Our optimised protocol includes pooling of at least 10 thrombocyte concentrates for the preparation of PL.
The optimal platelet concentrations for PL-preparation appeared to be 1.5 x 109/ml when 5% of PL were added to the medium. Cells obtained by this protocol meet all
criteria for MSCs, e.g. plastic adherence, spindle-shaped morphology, surface marker expression, lack of hematopoietic markers, and differentiation capability into 3 mesenchymal lineages. MSC after passage 6 were cytogenetically normal and retained their immuneprivileged
potential by suppressing allogeneic reaction of T-cells. Taken together, our GMP-compatible protocol allows for safe and accelerated expansion of hMSC which could be of interest for cell and tissue therapies.

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