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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47550
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4755/


Untersuchungen neuer Funktionen der intrazellulären Domäne des Zelladhäsionsmoleküls L1 im Gehirn von Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Wolters, Gerrit

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Freie Schlagwörter (Deutsch): L1cam, regulierte Proteolyse , Kernimport , Gamma-Sekretase , Interaktionspartner
Freie Schlagwörter (Englisch): L1cam , regulated proteolysis , nuclear import , gamma-secretase , interaction partners
Basisklassifikation: 42.63
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Tiere (Zoologie)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.10.2009
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 30.08.2010
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wird die Kernlokalisation des Zelladhäsionsmolekuls L1 nach proteolytischer Prozessierung im zentralen Nervensystem von Mäusen zum ersten Mal beschrieben. Immunhistochemische Untersuchungen an primären Kleinhirnneuronen sowie an neuronalen Zelllinien der Typen N2a und SH-SY5Y konnten mittels eines gegen die intrazelluläre Domäne von L1 gerichteten Antikörpers am Laser Scanning Mikroskop die Lokalisierung im Zellkern zeigen. Um die Frage zu klären, in welcher Form L1 in den Zellkern von Neuronen gelangt, wurden unterschiedliche Gehirnhomogenate und Kernfraktionen im Immunblot mit spezifischen L1-Antikörpern untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L1 im Nervensystem stark prozessiert wird und eine Vielzahl an proteolytischen Spaltprodukten existiert. Die Analyse von Kernfraktionen aus Kleinhirnneuronen zeigte, dass einige dieser carboxyterminalen Fragmente, L1-70, L1-32, L1-28 und L1-15 in den Zellkern translozieren.
Dies trifft auch auf die untersuchten Gehirnareale des Cerebellums, Hippocampus und Cortex zu. Der zu Grunde liegende proteolytische Mechanismus konnte durch die Inhibition von Metalloproteasen (GM6001) sowie des gamma-Sekretase Komplexes (DAPT) aufgeklärt werden. ADAM10 generiert konstitutiv durch einen membran-proximalen Schnitt in der extrazellulären Domäne von L1 den membranständigen Stumpf L1-32. Dieser wird von der gamma-Sekretase durch einen Intramembran-Schnitt weiter prozessiert und führt zur Entstehung der löslichen intrazellulären Domäne von L1 (L1-15/28/45). Die Stimulation mit Ionomycin erhöht die Rate an endozytiertem L1 und führt zur verstärkten Prozessierung durch ADAM17 und die gamma-Sekretase, was allerdings keine Stimulation des L1-Kernimports nach sich zog. Die Stimulation von SH-SY5Y Zellen mit physiologischen Konzentrationen an Glutamat zeigte eine Reduzierung von Oberflächen-L1 um 35 %, aber keinen erhöhten Kernimport von L1.
Der monoklonale L1-Antikörper L1-557 ist dafür bekannt, L1-abhängiges Neuritenwachstum und die einhergehende Endozytose von L1 in vitro zu stimulieren. In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die Behandlung von Kleinhirnneuronen mit L1-557 zu einer erhöhten Rate an prozessiertem L1 führt und der L1-Kernimport stimuliert wird. Die L1-Formen, die verstärkt in den Zellkern gelangen, sind L1-70 und L1-32. Eine Besonderheit stellt die Bande L1-70 dar, welche extrazelluläre Bestandteile enthält und in neuronalen Kernfraktionen detektierbar ist. Die an der Entstehung dieser Schnittform beteiligte Protease ist nicht geklärt, könnte aber durch eine potentielle Prozessierung der Serinprotease Matriptase hervorgerufen werden.
Durch eine in silico Motivsuche innerhalb der Aminosäuresequenz der L1-ID konnten zwei Kernlokalisierungsmotive (NLS) identifiziert werden. Bindungsstudien mit der rekombinant exprimierten L1-ID konnten zeigen, dass Importin aplha an L1 bindet, nicht aber an die intrazelluläre Domäne von NCAM140, welche das Motiv nicht enthält.
Seit kurzem ist im Gespräch, dass die post-translationalen Modifikationen der Monoubiquitinylierung und Sumoylierung wichtige Signale für die Lokalisierung von Proteinen darstellen. In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass L1 sowohl mono- als auch polyubiquitinyliert in Endosomenfraktionen vorkommt. Die monoubiquitinylierten Formen L1-70 und L1-50 beinhalten die L1-ID und können bei der Translozierung in den Zellkern eine wichtige Rolle spielen. In der Aminosäuresequenz von L1 gibt es potentiell relevante Sumoylierungsmotive. Die Analyse von L1-ID Immunpräzipitaten aus einer Kernfraktion mit einem Sumo-Antikörper, zeigte dass sumoylierte L1-ID im Zellkern in den Formen L1-40 und L1-30 vorkommt.
Die Suche nach Bindungspartnern der L1-ID aus dem Zellkern wurde über eine Affinitätschromatographie verwirklicht. Parallel wurde kovalent an eine Matrix gekoppelte L1- oder NCAM140-ID verwendet, um aus einer nukleoplasmatischen Kernfraktion Bindungspartner zu isolieren. Die Proteine Importin beta, NonO, SFPQ, PSP1, Topoisomerase I und MeCP2 konnten in der angeschlossenen massenspektrometrischen Analyse als spezifische L1-Interaktionspartner identifiziert werden. Durch Pulldown-Experimente, Immunpräzipitationen und Studien zur Co-Lokalisierung konnten die Interaktionen zwischen L1-ID und NonO, MeCP2 sowie SFPQ bestätigt werden.
Kurzfassung auf Englisch: In this study, the nuclear translocation of the cell adhesion molecule L1 after proteolytic cleavage in the central nervous system could be shown for the first time.
Immunhistochemical stainings of primary cultured cerebellar neurons as well as on the neuronal cell lines N2a and SH-SY5Y using an antibody against the L1-ID could show the nuclear localization via laser scanning microscopy. To address the question whether L1 nuclear import depends on proteolytic cleavage, different brain homogenates and nuclear fractions were subjected to western blot analysis using L1 specific antibodies. It could be shown that L1 is being heavily proteolyticly processed in the nervous system and that a variety of cleavage products exist. The analysis of nuclear fractions derived from neuronal culture shows that carboxyterminal fragments L1-70, L1-32, L1-28 and L1-15 translocate into the nucleus. This applies also to the examined brain areas cerebellum, hippocampus and cortex.
The proteolytic mechanism lying to reason could be cleared up by inhibiting metalloproteases (GM6001) as well as the gamma-secretase complex (DAPT). ADAM10 constitutively cleaves L1 membran proximal generating a stump of the size of 32 kDa. This stump is further processed by the gamma-secretase releasing the L1-ID (L1-15/28/45) into the cytoplasm.
The stimulation induced by ionomycin triggers L1-cleavage by ADAM17 followed by gamma-secretase but does not influence nuclear localization of L1. Stimulation of SH-SY5Y cells with physiologic concentrations of glutamate led to a 35 % reduction of cell surface L1 but did not alter the nuclear import of L1.
The monoclonal antibody L1-557 is known to stimulate L1-dependent neurite outgrowth and the going along of L1-endocytosis. In this study it is shown that treatment of cerebellar cultured neurons with L1-557 leads to an increase of L1 proteolysis and translocation to the nucleus. The processed forms of L1 which undergo nuclear translocation are L1-70 and L1-32. It is noteworthy that L1-70 contains extracellular parts of L1 and is detectable in nuclear fractions derived from neuronal culture. The protease generating this fragment is still unknown but the serine protease matriptase might be a possible candidate. An in silico search for small conserved motifs in the amino acid sequence of L1 could identify two nuclear leading sequences (NLS) within the L1-ID. Binding studies using a recombinant expressed form of L1-ID could show that importin alpha binds to L1 and not to NCAM140-ID which is not bearing this motif.
Recently, the post-translational modifications ubiquitin and sumo are being discussed of being signals mediating protein localization. In this thesis it could be shown that L1 is both mono- and polyubiquitinylated present in endosomal fractions. The L1-ID containing monoubiquitinylated Forms L1-70 and L1-50 may play a distinct role in the translocation of L1 to the nucleus.
The amino acid sequence of L1-ID shows some potential sumoylation sites with high physiological relevance. Analysis of L1-ID immunprecipitates from nuclear fractions using an antibody against sumo could show that sumoylated carboxyterminal fragments of L1 exist.
The search for nuclear binding partners of the L1-ID was performed using affinity chromatography. In parallel, the intracellular domains of L1 and NCAM140 were coupled to a matrix and used as baits for nuclearplasmatic interactors. Following proteins could be identified as specifically L1-binders, using mass-spec analysis: Importin beta, NonO, SFPQ, PSP1, topoisomerase I and MeCP2. Pulldown experiments, immunprecipitations and colocalisation studies could verify the binding of NonO, MeCP2 and SFPQ to L1-ID.

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