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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47597
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4759/


Identifizierung gering konzentrierter diagnostischer Glykoproteine in humanem Plasma mittels Affinitäts-Chromatographie und Massenspektrometrie 

Tandem Affinity Depletion: A combination of affinity fractionation and immunoaffinity depletion allows the detection of low-abundance components in the complex proteomes of body fluids

Seyed Mortezai, Naghmeh

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SWD-Schlagwörter: Glykosylierung , Glykoproteine , Biomarker , Massenspektrometrie , LC-MS , Antikörper , Lectine , Blutplasma , Chromatographie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Carcinoembryonales Antigen
Basisklassifikation: 35.26 , 35.29
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Wagener, Christoph (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.12.2009
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 09.09.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die 
Entwicklung eines empfindlichen Verfahrens, das es 
ermöglichen soll, gering konzentrierte diagnostisch 
relevante Glykoproteine in humanem Plasma zu identifizieren,
ohne dass deren Identität im Vorhinein bekannt ist. 
Hierfür wurden zwei affinitätschromatographische Schritte 
miteinander kombiniert. Zunächst wurde eine Anreicherung 
der im Plasma vorhandenen Glykoproteine aus einem Pool 
gesunder Kontrollpersonen über eine Wheat Germ Agglutinin 
(WGA) Affinitäts Chromatographie vorgenommen. 
Durch die Lektinfraktionierung des humanen Plasmas konnten 
ca. 96 % der gesamten Plasmaproteinmenge abgetrennt werden. 
Um die Analyse gering konzentrierter Plasmaproteine in der WGA gebundenen Fraktion zu ermöglichen, war eine selektive Abtrennung 
von regulär vorkommenden Proteinen der Glykoproteinfraktion 
erforderlich. Die WGA gebundene Plasmaproteinfraktion Gesunder wurde für die 
Immunisierung eines Lamas eingesetzt, um hochspezifische 
Antikörper gegen die Glykoproteine des Normalplasmas zu 
erhalten. Cameliden (Kamele und Lamas) bilden neben 
konventionellen Antikörpern eine besondere Form von 
Antikörpern, bei denen die leichte Kette und die 
CH1 Domäne deletiert sind. Diese sogenannten 
Schwerketten Antikörper besitzen im Vergleich zu konventionellen 
Antikörpern eine höhere chemische und thermische Stabilität.
Durch die gerichtete Immobilisierung der Schwerketten Antikörper an eine Hydrazidmatrix wurde ein Immunabsorbens mit hoher Stabilität hergestellt, 
das bis zu 98 % der WGA gebundenen Plasmaproteine binden 
konnte. Da die Cameliden Antikörper nur gegen Glykoproteine gerichtet sind, die 
in Normalplasma vorkommen, sollten Proteine, die die 
WGA gebundene Proteinfraktion aus Normalplasma nicht enthält, 
nicht gebunden werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, 
wurde ein glykosyliertes Testprotein eingesetzt, das 
Carcinoembryonale Antigen (CEA), das im Plasma Gesunder 
nur in sehr geringen Mengen vorkommt, dessen 
Plasmakonzentration jedoch beim Kolonkarzinom stark erhöht ist. 
Ein Plasmapool aus gesunden Kontrollpersonen wurde mit CEA
(20 pmol/ml) versetzt, die WGA gebundene Glykoproteinfraktion isoliert und eine 
Abreicherung der Proteine 
des Normalplasmas mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Matrix aus immobilisierten Cameliden-Schwerketten-Antikörpern durchgeführt. Hierbei wurde das CEA nicht 
signifikant vom Immunabsorbens gebunden. Im Durchlauf der 
Immun Affinitäts Chromatographie konnte das CEA mittels einer LC MSE Analyse detektiert werden. Anschließend wurden die 
WGA gebundenen Plasmaproteinfraktionen von zwei 
Kolonkarzinompatienten über das Immunabsorbens 
aufgearbeitet. Auch in diesem Fall konnte das CEA im 
Durchlauf der Affinitäts Säule angereichert und mittels 
der LC MSE Analyse detektiert werden. 
Durch den Einsatz derartiger Affinitäts Säulen eröffnet sich daher die Möglichkeit, durch die 
Abreicherung der im Plasma Gesunder regulär vorkommender 
Glykoproteine eine entsprechende Anreicherung von 
diagnostich relevanten gering konzentrierten 
Markerproteinen zu erreichen. In jedem Fall muss das 
diagnostisch relevante Glykoprotein Glykanreste tragen, 
die eine spezifische Bindung zum Lektin erlauben und 
in der angereicherten Glykoproteinfraktion mit einer 
Konzentration grösser 20 pmol/ml vorkommen.
Kurzfassung auf Englisch: The identification and quantification of characteristic changes in the plasma proteome can potentially be helpful in early diagnosis of a disease and monitoring of a therapy. Due to the enormous complexity and the biological heterogeneity of the human plasma proteome, the discovery of biomarkers in the low concentration range of plasma requires the depletion of highly abundant proteins. Therefore, for the detection of minor components fractionation is always required. Here we report on a tandem affinity strategy for the identification of low abundant glycosylated protein biomarkers of human plasma: In the first step we isolated a glycosubproteome of the human plasma by wheat germ agglutinin (WGA) lectin affinity chromatography. In the second step, the proteins of this subproteome were used to raise antibodies in llama (Lama glama). The heavy chain fraction of the llama antibodies was used to deplete from the WGA lectin binding fraction all proteins normally found in human plasma. In this way we selectively enriched proteins specific for a pathological state. As a proof of concept we applied this method to the analysis of plasma samples from colon cancer patients. We could demonstrate the selective enrichment of the cancer marker CEA by a factor of 600-800. For the identification and label-free quantification of the proteins isolated by this strategy electrospray QTOF LC/MS mass spectrometry was applied, using the data-independent MSE technique.

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