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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47631
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4763/


Die Rolle der Serpentin-Rezeptoren Fzd8 und Fzd9 im Knochenremodelling

The role of the serpentine-receptors Fzd8 and Fzd9 in bone remodelling

Albers, Joachim

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Knochenremodelling , Wnt , Frizzled , Osteoporose
Freie Schlagwörter (Englisch): Bone remodelling , Wnt , Frizzled , Osteoporosis
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.07.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 14.09.2010
Kurzfassung auf Deutsch: LRP5 ist ein Co-Rezeptor für Wnt-Liganden, die bei zusätzlicher Bindung an Rezeptoren der Frizzled (Fzd)-Familie eine Aktivierung des intrazellulären Signalweges bewirken. Bislang wurde jedoch keines der 10 Fzd-Proteine mit Erkrankungen des Skelettsystems in Verbindung gebracht, obwohl diese als Serpentin-Rezeptoren ein vielversprechendes Target für eine osteoanabole Therapie darstellen könnten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von Fzd9 während der frühen Phase der Osteoblastendifferenzierung, parallel zu bekannten Osteoblastenmarkern, induziert wird. Während 6 Wochen alte Fzd9-/- Mäuse eine normale Knochenmasse aufweisen, zeigte die Analyse von 24 und 52 Wochen alten Tieren, dass diese ein um etwa 35 % erniedrigtes trabekuläres Knochenvolumen haben. Durch dynamische Histomorphometrie konnte diese Osteopenie auf eine um 50 % reduzierte Knochenformationsrate zurückgeführt werden, während die Knochenresorption nicht beeinflusst ist.
Eine verminderte Proliferationsrate und verzögerte Mineralisierung deuten auf einen zellautonomen Defekt Fzd9-defizienter Osteoblasten hin, der jedoch nicht durch eine verminderte Expression etablierter Osteoblastenmarker wie Runx2, Osteocalcin oder Bone Sialoprotein erklärt werden kann. Sowohl durch Westernblotanalysen als auch mittels quantitativer RT-PCR konnte auf Protein- und mRNA-Ebene gezeigt werden, dass Fzd9, zumindest im Osteoblasten, keine entscheidende Rolle für die kanonische Wnt-Signaltransduktion spielt und dass somit auch die nicht-kanonische Wnt-Signaltransduktion eine wichtige Rolle für die Knochenformation spielt.
Zudem konnten mehr als 400 Gene identifiziert werden, deren Expression in Abwesenheit von Fzd9 um mehr als das zweifache reduziert war. Dabei waren hauptsächlich zwei Gruppen von Genen betroffen, nämlich Chemokine der Ccl- oder Cxcl-Familie sowie Gene, deren Expression bekanntermaßen durch Interferone induziert wird. Während die Chemokine als Zielgene eines durch Wnt5a induzierbaren Signalwegs identifiziert werden konnten, wurde die Expression der Interferon-abhängigen Gene in primären Osteoblasten spezifisch durch TypI-Interferone (Ifn und Ifn) induziert, wobei dieser Effekt in Fzd9-defizienten Osteoblasten signifikant erniedrigt war. Es konnte in dieser Arbeit außerdem herausgefunden werden, dass in Osteoblasten während der Differenzierung viele, bislang unidentifizierte Proteine mit Isg15 modifiziert werden und dass die ISGylierung einiger dieser Proteine in Fzd9-defizienten Osteoblasten offensichtlich gestört ist.
Zur Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Protein-ISGylierung für die Knochenformation, wurde ein Isg15-defizientes Mausmodell Knochen-histologisch analysiert und es konnte ein vergleichbarer Phänotyp wie in Fzd9-/- Mäusen identifiziert werden. Ein um 30 % erniedrigtes trabekuläres Knochenvolumen im Alter von 24 Wochen, sowie die signifikant verminderte biomechanische Stabilität der Röhrenknochen und Wirbelkörper, konnte mit einer erniedrigten Knochenformationsrate erklärt werden. Durch retrovirale Überexpression von Isg15 in Fzd9-defizienten Osteoblasten konnte außerdem eine partielle Korrektur des Mineralisationsdefektes erziehlt werden.
Ein Indiz dafür, dass FZD9 auch beim Menschen eine wichtige Rolle für die Knochenformation einnimmt, konnte durch die Analyse der Knochendichte von Williams-Beuren-Syndrom (WBS) Patienten erlangt werden. Bei dieser Erkrankung kommt es zur spontanen hemizygoten Deletion von etwa 20 Genen auf Chromosom 7, wobei eines dieser Gene FZD9 ist. Die vorausgehende Analyse von Fzd9+/- Mäusen ergab, dass auch die hemizygote Deletion von Fzd9 zu einem signifikanten Knochenmasseverlust führt. In einer anschließenden Studie konnte mittels DXA-Scanning die Knochendichte von 15 WBS-Patienten in drei unterschiedlichen skelettalen Regionen bestimmt werden, und es stellte sich heraus, dass bei einem durchschnittlichen T-Score unterhalb -1 laut WHO-Definition fast alle Patienten an einer Osteopenie oder Osteoporose litten.
Außerdem wurde in dieser Arbeit der Effekt des kanonischen Wnt-Signalwegs auf die Differenzierung von Osteoklasten aus Knochenmarkszellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die dauerhafte Stimulation des kanonischen Wnt-Signalwegs zu einer Unterdrückung der Osteoklastendifferenzierung führt.Der negative Effekt von Wnt3a auf die Osteoklastendifferenzierung konnte durch gleichzeitige Stimulation mit einer löslichen Fzd8-Rezeptorbindungsdomäne aufgehoben werden, was eine Bindung von Wnt3a an Fzd8 vermuten läßt. Die knochenhistologische Analyse von Fzd8-/- Mäusen zeigte, dass diese im Alter von 24 Wochen eine um 30 % erniedrigte Knochenmasse aufweisen. Diese Osteopenie konnte durch eine gesteigerte Knochenresorption erklärt werden, die nicht durch ein verändertes Opg/Rankl Verhältnis im Serum dieser Tiere hervorgerufen wird.
Kurzfassung auf Englisch: Lrp5 serves as a co-receptor for the binding of Wnt ligands to receptors of the Frizzled (Fzd) family. However, until now it is not known whether one of the 10 known Fzd proteins is relevant for bone remodelling or plays a role in the pathology of bone diseases. This is a major gap because FZD-proteins are serpentine receptors, thus belonging to a major class of target proteins for currently available drugs, and therefore they are interesting targets to develop an osteoanabolic therapy.
This work demonstrates that expression of Fzd9 is induced upon primary osteoblast differentiation together with known markers of osteoblast differentiation. The analysis of the skeletal phenotype of Fzd9-/- mice revealed no difference in trabecular bone volume at the age of 6 weeks, but at the age of 24 and 52 weeks, Fzd9-/- mice displayed a 35 % reduction of the trabecular bone volume. By performing dynamic histomorphometry this phenotype could be explained by a 50 % reduction of the bone formation rate, while bone resorption was not affected.
A decreased proliferation rate and a delayed matrix mineralization demonstrated that Fzd9-deficient primary osteoblasts display a cell autonomous defect that could not be explained by decreased expression of well-established osteoblast differentiation markers like Runx2, Osteocalcin or Bone Sialoprotein. In addition, the molecular analysis of Fzd9-deficient osteoblasts by Western Blotting or quantitative real time PCR did not reveal impaired canonical Wnt-signaling which demonstrated that non-canonical Wnt-signaling may also play an important role in the bone remodelling process.
Moreover, we observed reduced expression of specific chemokines of the Ccl or Cxcl family and interferon-induced genes in Fzd9-deficient osteoblasts. While the chemokines were identified as target genes of a non-canonical Wnt-Ligand (Wnt5a), the expression of the other genes was induced specifically by typeI-Interferons (Ifn and Ifn) in primary osteoblasts and most importantly this induction of gene expression was significantly less pronounced in Fzd9-deficient cells.
Western Blot analysis using an Isg15-specific antibody revealed an increase of free Isg15 and of yet unidentified ISGylated substrates during the differentiation process. Since this protein ISGylation was reduced in Fzd9-deficient osteoblasts, the physiological role of Isg15 was analyzed. Using non-decalcified histology and µCT-imaging of the spine, a 30 % reduction of the trabecular bone volume was observed. Likewise, microcompression testing of the vertebral bodies revealed reduced biomechanical stability, and the same was observed in three-point-bending assays of Isg15-/- femora. As it was observed in Fzd9-/- mice, this phenotype is caused by a reduced bone formation rate, while bone resorption is unaffected. Importantly, retroviral overexpression of Isg15 in Fzd9-deficient osteoblasts led to a partial rescue of the mineralization defect in these cells which means that the ubiquitin-like modifier Isg15 probably acts as one potential downstream mediator of Fzd9 in the control of bone formation.
Since FZD9 is located within the chrosomome 7q11.23 region, whose hemizygous deletion causes Williams-Beuren-syndrome (WBS), heterozygous Fzd9+/- mice were analyzed and here the same low bone mass phenotype as in Fzd9-/- littermates was observed. Most importantly however, an analysis of 15 individuals with WBS between 30 and 50 years of age by dual Xray energy absorptiometry revealed an average T-score below -1.0, with a manifest osteoporosis being diagnosed in 4 individuals.
Since it is yet not clear, whether alterations in Wnt-signaling have osteoblast-independent effects on the function or differentiation of osteoclasts, the effect of an activation of canonical Wnt-signaling on osteoclastogenesis was studied. It is shown here that activation of canonical Wnt-signaling suppresses osteoclast differentiation from bone marrow cells and also from Raw264.7 cells in vitro. Using a genome-wide expression analysis during the course of osteoclast differentiation from bone marrow cells, Frizzled-8 (Fzd8) was identified as a potential candidate receptor, regulating Wnt-signaling in osteoclasts. Since the negative influence of Wnt3a on osteoclast differentiation was fully abrogated in the presence of the Fzd8-Cysteine-rich-Domain (CRD), the skeletal phenotype of Fzd8-deficient mice was analyzed. Fzd8-/- mice display no differences in bone volume at the age of 6 weeks, but a 30% decrease of the trabecular bone volume in Fzd8-/- and also in Fzd8+/- mice was observed at 24 weeks of age. The observed osteopenia is explained by an increase in bone resorption which occurs despite normal levels of Opg and Rankl in the serum of these mice.

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