FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-47859
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4785/


Biosynthese von Glycosphingolipiden in Pichia pastoris

Biosynthesis of Glycosphingolipids in Pichia pastoris

Wobbe, Tobias

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (5.945 KB) 
pdf gepackt:
 Diss_Tobias_Wobbe__Anhang.zip (5,367 KB) 


SWD-Schlagwörter: Lipide , Lipidstoffwechsel , Hefeartige Pilze , Instrumentelle Analytik , Analytische Chemie , Chromatographie , Flüssig-Fest-Chromatographie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Sphingolipide , Ceramide
Freie Schlagwörter (Englisch): substrate-channeling
Basisklassifikation: 35.78 , 35.26 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Warnecke, Dirk (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.08.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 15.10.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Sphingolipide sind eine Gruppe von Lipiden, die in Biomembranen aller Eukaryoten und mancher Prokaryoten vorkommen. Ihren hydrophoben Kern bildet das Ceramid, bestehend aus einer Sphingobase und einer amidgebundenen Fettsäure. Die hydrophile Kopfgruppe ist oftmals aus verschiedenen Zuckern aufgebaut (Glycosphingolipide). Sie sind Bestandteile spezieller Membranbereiche, den Membranmikrodomänen („Lipid-rafts“). Darüberhinaus nehmen Sphingolipide in verschiedenen zellbiologischen Abläufen Funktionen von Signalmolekülen ein.
Nahezu alle eukaryoten Lebewesen synthetisieren verschiedene Klassen von Sphingolipiden, die über distinkte Strukturmerkmale charakterisiert sind. Ziel dieser Arbeit war es aufzuklären, wie die Hefe Pichia pastoris zwei unterschiedliche Sphingolipid-Klassen synthetisiert: Glucosylceramid (GlcCer) bestehend aus der Sphingobase 9-Methylsphinga-4,8-dienin und der Fettsäure 2-Hydroxyoctadecansäure als Ceramidgrundgerüst und einer Glucose-kopfgruppe. Die andere Klasse ist Inositolphosphorylceramid (IPC) mit der Sphingobase 4-Hydroxysphinganin verknüpft mit einer 2-Hydroxytetracosansäure und einer Inositolphosphat-Kopfgruppe.
Im ersten Schritt gelang es zu bestimmen, wie die unterschiedlichen Ceramidgrundgerüste separat voneinander synthetisiert werden: P. pastoris besitzt zwei Gene für Ceramidsynthasen, BAR1 und LAG1. Durch die Deletion von Bar1 und anschließende Enzymassays konnte nachgewiesen werden, dass dieses Enzym für die Herstellung der Glucosylceramid-typischen Ceramide verantwortlich ist. Dieses wird durch Substratspezifität für die jeweilige Sphingobase und Fettsäure erreicht. Die Vermutung, dass Lag1 die IPC-typischen Ceramide synthetisiert, konnte nicht bestätigt werden. Versuche zur Charakterisierung dieses Enzyms deuten darauf hin, dass die Synthese von Inositolphosphorylceramid essentiell für das Wachstum von P. pastoris ist.
Im zweiten Schritt sollte festgestellt werden, wie die Umsetzung der unterschiedlichen Ceramide zu den Endprodukten reguliert wird. Hierfür wurde über verschiedene analytische Methoden (HPLC, GC, LC-TOF) die Struktur der gebildeten Sphingolipide in verschiedenen P. pastoris-Stämmen bestimmt. In den untersuchten Stämmen war jeweils ein Gen des GlcCer-Biosynthesewegs deletiert: Ceramidsynthase BAR1, Fettsäure-alpha-Hydroxylase (SCS7), Sphingolipid-delta4-Desaturase, Sphingolipid-delta8-Desaturase, Sphingolipid-C9-Methyltransferase oder Glucosylceramidsynthase (GCS).
Es konnte gezeigt werden, dass die delta4-Desaturierung der Sphingobase und die alpha-Hydroxylierung der Fettsäure essentiell für die Bildung von GlcCer sind. Ceramide können auch ohne diese Modifikationen gebildet werden, werden aber nicht zu GlcCer umgesetzt. Die Analyse von Mutanten, in welchen die Glucosylceramidsynthase überexprimiert wurde, zeigt, dass dieses Enzym substratspezifisch für delta4-desaturierte und alpha-hydroxylierte Ceramide ist.
Zusätzlich zu diesem Effekt konnte noch ein weiterer Mechanismus für die getrennte Synthese von Glucosylceramid und Inositolphosphorylceramid ausgemacht werden. Bei Überexpression der Gcs werden auch die IPC-typischen Ceramide zu GlcCer umgesetzt. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Gcs nicht spezifisch für die Kettenlänge der Fettsäure ist und zudem nicht zwischen C4-Hydroxylierung und C4-Doppelbindung der Sphingobase unterscheidet. Die getrennte Synthese von GlcCer und IPC wird also nicht durch die Spezifität der Glucosylceramidsynthase für die Ceramidstruktur erreicht. Die Ergebnisse deuten viel mehr darauf hin, dass die Umsetzung der verschiedenen Ceramide zu GlcCer respektive IPC über eine räumliche Trennung der Enzyme (Gcs und IPC-Synthase) geregelt wird. Hierbei wären die Gcs und die IPC-Synthase an verschiedenen Orten in der Zelle lokalisiert und bekämen jeweils nur die entsprechenden Ceramide zugeführt (GlcCer-typische zur Gcs und IPC-typische zur IPC-Synthase). Für dieses Modell ist ein spezifischer Transport der Ceramide zu diesen Enzymen notwendig. Als mögliche Strukturmerkmale, die einen spezifischen Transport der Ceramide regulieren, wurden die Kettenlänge der Fettsäure und/oder die delta4-Desaturierung der Sphingobase sowie alpha-Hydroxylierung der Fettsäure ausgemacht.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende