Cytokinin profiling beim Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.- Einflüsse von Cytokinin-Oxidase/Dehydrogenase sowie Adenosin-Kinase

Abstract

Cytokinine sind Phytohormone, die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Pflanzen spielen. Die Arbeit befasst sich mit der Cytokinininterkonversion sowie mit dem Cytokininabbau bei der Modellpflanze Physcomitrella patens. Ziele der Arbeit waren: (a) umfassende Analyse des Cytokinin-Spektrums für den Bryophyten Physcomitrella, (b) Aufklärung der Rolle der beiden Cytokinin-metabolisierenden Gene - Adenosin-Kinase (ADK) und Cytokinin-Oxidase/Dehydrogenase (CKX) - mit Hilfe von transgenen Pflanzen, (c) bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung der ADK- sowie CKX-Multigenfamilien in Physcomitrella. Mit Hilfe der LC-MS-basierten Erstellung des Cytokinin-Spektrums konnten insgesamt beim Physcomitrella Wildtyp 21 verschiedene Cytokinin-Metabolite identifiziert werden, die 6 verschiedenen Cytokinin-Gruppen angehören. Neben den bereits bei Physcomitrella zuvor nachgewiesenen Derivaten von Isopentenyladenin (iP) und trans-Zeatin (tZ), wurden Metabolite von cis-Zeatin (cZ) und dihydro-Zeatin (dHZ) als weitere Isoprenoid-Cytokinine gefunden. Zum ersten Mal für Bryophyten wurden auch die aromatischen Cytokinine Benzyladenin (BA) und Topolin (T) nachgewiesen. Intrazellulär stellten die cZ-Formen die Hauptcytokinine dar, mit cis-Zeatin-Ribosid-O-Glucosid als Hauptmetabolit; extrazellulär stellten dagegen die iP-Formen die Hauptcytokinine dar, mit dem Hauptmetaboliten Isopentenyladenosin-Monophosphat. Das Enzym Adenosin-Kinase (ADK) katalysiert u.a. die Interkonversion von Cytokinin-Ribosiden zu den entsprechenden Nukleotiden. Zusätzlich zu dem bei Physcomitrella bekannten PpADK1-Gen (Schwartzenberg et al., 1998) wurden in genomischen Datenbanken 2 weitere PpADK-Gene identifiziert und bioinformatisch charakterisiert. Auf der Grundlage von EST-Evidenzen kann davon ausgegangen werden, dass auch diese ADK-Gene exprimiert werden. Die PpADK-Gene weisen zueinander eine hohe Identität auf (59-87%). Analog zu anderen ADKs besitzen die PpADKs mit 10-12 Introns eine sehr fragmentierte Genstruktur. Zur Aufklärung der Rolle von PpADK1 wurde Physcomitrella mit einem Actin1:PpADK1-Konstrukt transformiert und die erhaltenen Transformanten (tADK1) wurden anschließend hinsichtlich Cytokininstatus und Phänotyp charakterisiert. Durch LC-MS-Analysen konnte für die ADK1-Transformanten eine intrazelluläre Senkung der Konzentrationen von cZR und cZRMP, mit Werten, die nur 6,8% bzw. 3,7% des Wildtyp Gehalts entsprechen, sowie eine intra- und extrazelluläre Steigerung von cZROG im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden. Für die restlichen Cytokinin-Formen wurden keine einheitlichen Änderungen im Vergleich zum Wildtyp festgestellt. Als phänotypische Folgen der Transformation konnte eine Verlängerung der Rhizoide sowie die Bildung mittelständiger Rhizoide am Cauloid beobachtet werden, sowie eine vorzeitige Vergilbung der Phylloide. Cytokinin-Oxidase (CKX) katalysiert den irreversibeln Abbau der iP-, cZ-, tZ-Basen und -Riboside. Mittels bioinformatischer Sequenzanalysen wurden 6 Mitglieder der CKX-Multigenfamilie von Physcomitrella identifiziert und charakterisiert. Diese clustern in 2 Gruppen und enthalten 2 bis 5 Introns. Die CKX-Gene von Physcomitrella besitzen zusammen mit denen des Moosfarns S. moellendorffii mit bis zu 5 Introns die größte Fragmentierung im Vergleich zu den bisher bekannten CKX-Genen. Die hergestellten transgenen Pflanzen (tCKX), die das Arabidopsis AtCKX2-Gen konstitutiv überexprimierten, zeigten eine starke Erhöhung (bis ca. 220-fach) der extrazellulären CKX-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp. Mit Ausnahme einer Reduktion von tZ (16% des Wildtyp Gehalts), konnten intrazellulär keine wesentlichen Veränderungen des Cytokininprofils nachgewiesen werden. Extrazellulär hingegen trat eine starke Reduktion von iP bzw. iPR (auf 1,8% bzw. 5% des Wildtyp Gehalts) sowie eine Reduktion des iPRMP (auf 50% im Vergleich zum Wildtyp) auf. Die gesteigerte CKX-Aktivität bei den tCKX-Pflanzen führte zu einer Senkung des Gesamt-Cytokinin-Gehalts, wobei nur 68 bis 80% des beim Wildtyp vorliegenden Gesamt-Cytokinin-Gehalts gemessen wurden. Bei den tCKX-Transformanten konnten phänotypische Veränderungen nachgewiesen werden: (a) Protonema-Zellen waren kürzer und runder, (b) cytokininabhängige Knospenbildung trat später ein, (c) Gametophoren zeigten im Vergleich zum Wildtyp eine verfrühte Vergilbung, (d) bedingt durch die vollständige Abwesenheit von Antheridien und Archegonien waren die Pflanzen nicht in der Lage, Sporophyten zu bilden. Aus den präsentierten Daten werden Rückschlüsse auf die Bedeutung von Cytokininen für die Wachstumssteuerung von Laubmoosen gezogen. Während im Fall der Adenosin-Kinase der genaue Mechanismus der gezeigten Einflussnahme auf Cytokiningehalt und Phänotyp noch einer weiteren Klärung bedarf, wird die wichtige Rolle der Cytokinin-Oxidase/Dehydrogenase für die Regulation der endogenen Cytokininaktivität bei Physcomitrella anhand der dargelegten Untersuchungsergebnisse deutlich.

Cytokinins are phytohormones that play a crucial role in plant development.

This work focuses on interconversion and degradation as important cytokinin metabolic steps using the model plant Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. The topics addressed were: (a) comprehensive analysis of the cytokinin profile in the bryophyte Physcomitrella, (b) elucidation of the importance of adenosine kinase (ADK) and cytokinin oxidase/dehydrogense (CKX) in the cytokinin metabolism by generation of overexpression plants, (c) the bioinformatic identification and characterisation of the ADK- as well as CKX multigene family in Physcomitrella. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) was used to establish the cytokinin profile of the Physcomitrella wild type, a total of 21 cytokinin metabolites belonging to six different cytokinin groups were identified. Besides the previously identified metabolites isopentenyladenine (iP) and trans-zeatin (tZ) the isoprenoid metabolites cis-zeatin (cZ) and dihydro-zeatin (dHZ) were also found. For the first time in bryophytes the aromatic cytokinins benzyladenine (BA) and topolin (T) were detected. In addition, it was seen that the cZ-forms represent the most abundant intracellular metabolites with a high accumulation of the glucoside cZROG. However, the highest extracellular accumulated forms are the iPs where the isopentenyladenosine monophospahe (iPRMP) appeared to be the main metabolite. The enzyme adenosine kinase (ADK) catalyses amongst others the phosphorylation of cytokinin ribosides to the corresponding nucleotides. In addition to the already known PpADK1-gene (Schwartzenberg et al., 1998) two more Physcomitrella ADK-genes were identified in the database and bioinformatically characterised. The existence of corresponding ESTs indicates that they are also expressed genes. The comparison of the deduced PpADKs amino acid sequences revealed a high identity to each other (59-87%). Analogue to other plant ADK genes the PpADKs show with 10-12 introns a very high fragmentation of their gene structure. In order to clarify the importance of PpADK1 transgenic plants were generated carrying an actin 1: PpADK1 overexpression construct. Eventually an analysis of the cytokinin status and phenotypic characteristics of the obtained transgenic Physcomitrella plants was realised. The LC-MS analysis of the ADK1-transgenic plants revealed a decrease of the intracellular concentrations of cZR and cZRMP of 6,8% to 3,7% respectively compared to wild type as well as an intracellular and extracellular increase of cZROG. However for all other cytokinin metabolites non-uniform variations in the cytokinin levels between wild type and transgenic plants were measured. Phenotypic changes such as elongation of the rhizoids and mid-stem rhizoids as well as premature yellowing of phylloids were observed.

Cytokinin-oxidase/dehydrogenase (CKX) is responsible for the irreversible degradation of iP-, cZ-, tZ-bases and their ribosides. In the Physcomitrella genome 6 members of the CKX-multigene family were identified and characterised. The genes clustered in two groups and comprise 2 to 5 introns. The Physcomitrella CKX-genes exhibit together with the ones from moosfern Selaginella moellendorffii with up to 5 introns the highest fragmentation of the until now known CKX-genes. After transformation with the constitutively overexpressed Arabidopsis AtCKX2-gene, a substantial increase (up to 220-fold) of the extracellular CKX-activity was shown in the transgenic plants in contrast to wild type. With the exception of the decrease of the tZ (16% of wild type content) non-essential variations of the intracellular cytokinin profile were determined. However, a strong extracellular decrease of iP and iPR (representing only 1,8% and 5% of the wild type content respectively) as well as a reduction of the nucleotide iPRMP (up to 50% compared to the wild type). The increased CKX activity in the tCKX transgenic plants caused a decrease of the total concentration of cytokinins, presenting only 68 to 80% of the concentration measured for the wild type. In the tCKX trangenic plants several phenotipic alterations also occurred: (a) protonema cells appeared to be shorter and rounder, (b) delayed cytokinin dependent bud formation, (c) exhibition of premature yellowing of the gametophores compared to wild type, (d) due to the total absence of antheridia and archegonia, plants showed inability to develop sporophytes. The observed changes in the CKX overexpressing plants point out the significance of extracellular cytokinins for the growth control in mosses. While in the case of adenosine kinase its influence on the cytokinin content and phenotype needs further examination, the results obtained for cytokinin oxidase/dehydrogenase demonstrate the important role of this enzyme for the regulation of cytokinin activity in Physcomitrella.