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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48110
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4811/


Keimzelltumore und Cisplatinresistenz: Bildung von DNA-Addukten, Auswirkungen auf Zellzyklus und Zelltod und Beteiligung von DNA-Reparaturmechanismen

Germ cell cancer and cisplatin resistance: formation of DNA adducts, impact on cell cycle and cell death and involvement of DNA repair mechanisms

Fenske, Annabelle Elisabeth

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SWD-Schlagwörter: Keimzelltumor, Cisplatin, Resistenz, DNA-Schaden, Zellzyklus, Zelltod, DNA-Reparatur
Freie Schlagwörter (Deutsch): DNA-Addukte
Basisklassifikation: 44.81
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dartsch, Dorothee (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.09.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 15.10.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche Mechanismen an einer Resistenz bzw. Resistenzentwicklung von Keimzelltumoren des Hodens gegenüber Cisplatin (CDDP) beteiligt sind. Die Untersuchungen erfolgten in vitro an den Embryonalkarzinomzelllinien NT-2 und ihrer generierten, CDDP-resistenten Sublinie NT-2-R sowie der Seminomzelllinie TCam-2. CDDP wurde in Anlehnung an die unterschiedlichen Therapieprotokolle über verschiedene Zeiten eingesetzt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die drei Zelllinien ganz unterschiedliche Resistenzniveaus aufwiesen und dass diese Unterschiede für kurze Inkubationszeiten ausgeprägter waren. Es waren zwischen den Zelllinien keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Bildung der Platinaddukte zu beobachten. Unterschiede in der CDDP Aufnahme bzw. CDDP Eliminierung scheinen daher für die Unterschiede in der CDDP Empfindlichkeit keine Rolle zu spielen. Nach einer Kurzbehandlung über 3 h schienen NT-2-R-Zellen diese Addukte allerdings effizienter entfernen zu können als die NT-2-Zellen und auch effizienter als nach einer längeren Behandlungszeit. Eine CDDP-Behandlung induzierte in den NT-2-R-Zellen die Expression von ERCC1 und pol ß. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Zellen versuchen, die DNA-Schäden zu reparieren, aber die Kapazität des Reparatursystems begrenzt ist. Sie lassen außerdem vermuten, dass eine erhöhte Schadenstoleranz eher an der Resistenzentwicklung und den Unterschieden zur Elternzelllinie NT-2 beteiligt zu sein scheint. Auch hier scheint die Kapazität begrenzt. Die bekannte Fehleranfälligkeit der pol ß könnte zu dieser verminderten Kapazität zusätzlich beitragen.
In den TCam-2-Zellen wurde der höchste ERCC1-Gehalt gemessen. Der Gehalt dieses Proteins konnte in anderen Zellkulturmodellen sowie in Patientenzellen als Marker einer CDDP-Resistenz identifiziert werden. Die hier gewonnenen Ergebnisse unterstützen diese Vermutung. Die erhöhte ERCC1-Expression war allerdings nicht mit einer erhöhten Fähigkeit der Adduktentfernung assoziiert.
Die Ergebnisse zeigten außerdem, dass nach einer CDDP-Inkubation in den untersuchten Keimzelltumorzelllinien die Bildung von yH2AX-Foci induziert wird. Es wird postuliert, dass aufgrund einer Adduktreparatur und geblockter Replikationsgabeln DNA-DSB entstehen. Induktion und Ausmaß dieser sekundären DNA-Schädigungen waren in den NT-2-R-Zellen tendenziell geringer und in den TCam 2 Zellen eher höher ausgeprägt. Die Unterschiede waren in den drei Zelllinien statistisch nicht signifikant. Die sekundären DNA-Schädigungen scheinen für die unterschiedlichen Resistenzniveaus weniger bedeutend zu sein.
Die größten Unterschiede zwischen den Zelllinien wurden in den Zellzyklusanalysen sowie in der Zelltodinduktion gefunden. Eine CDDP-Behandlung führte in den NT-2- und NT-2-R-Zellen zu einer transienten S-Phase-Verschiebung gefolgt von einem G2/M-Arrest. Diese führte zu einem deutlichen Anstieg der sub-G1-Fraktion. Diese Effekte waren in den NT-2-Zellen stärker ausgeprägt. Der Zelltod in den NT-2-Zellen war durch eine DNA-Fragmentierung und einen Verlust der Membranintegrität charakterisiert. Diesem fehlte aber eine Präsentation von Phosphatidylserin, einem Kennzeichen der Apoptose. Die TCam-2-Zellen zeigten nach einer CDDP-Behandlung nur minimale Veränderungen in der Zellzyklusverteilung. Auch eine Bestrahlung führte nicht zu einem Zellzyklusarrest. Es konnte auch keine Reparatur der strahleninduzierten DSB beobachtet werden. Bereits in früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine BRCA1-Expression mit einer CDDP- und Radioresistenz assoziiert ist. Dies scheint an dessen Apoptose-modulierender Eigenschaft zu liegen. BRCA1 wurde einzig in den TCam-2-Zellen exprimiert.
Die Ursachen der beobachteten Resistenzunterschiede in den drei Zelllinien liegen vermutlich in veränderten, unterdrückten oder modulierten Zelltod-Signalwegen. Eine verstärkte DNA-Reparatur scheint nur eine untergeordnete Rolle für die Resistenzentwicklung zu spielen. Wie groß die klinische Bedeutung dieser Mechanismen ist, wird sich in zukünftigen Untersuchungen zeigen.
Kurzfassung auf Englisch: This thesis is dealing with the question, which molecular mechanisms are involved in resistance and development of resistance in testicular germ cell cancer against CDDP, respectively. In an in vitro model the embryonal carcinoma cell line NT-2 and its CDDP-adapted counterpart NT-2-R as well as the seminoma cell line TCam-2 were investigated. According to the existing therapy regimes CDDP was used for different time periods.
The results show that the three cell lines exhibit different resistance levels and that these differences were more pronounced for shorter incubation periods. Differences in adduct formation were statistically non significant. Therefore, neither CDDP uptake nor CDDP elimination seem to be responsible for the different resistance level. After 3 h of incubation, NT-2-R cells seemed to remove these adducts more efficiently than NT 2 cells and more efficiently than after longer incubation periods. In NT-2-R cells, incubation with CDDP induced the expression of ERCC1 and pol ß. These data indicate that the cell lines try to repair the DNA damage but capacity of the repair system seems limited. Presumably, rather an elevated damage tolerance is involved in the development of resistance and the differences compared to the parental line NT-2. Likewise, capacity seems limited. Additionally, the proven low-fidelity of pol ß might additionally restrict this capacity.
The highest ERCC1 level was measured in TCam-2 cells. ERCC1 expression level was found to be a marker for CDDP resistance, as shown in other cell culture models as well as tumor samples, which is confirmed by the results of the TCam-2 cells. However, the elevated protein expression was not associated with an elevated capability of adduct removal.
Here, it was shown that CDDP induced the formation of γH2AX-Foci in the analyzed germ cell cancer cell lines. It is postulated that DNA double strand breaks occurred because of an adduct repair and stalled replication forks. By trend, induction and extent of such secondary DNA damage was less pronounced in NT-2-R cells and more pronounced in TCam-2 cells. Differences between the three cell lines were not statistically significant. However, formation of these secondary DNA damage seemed to be of minor importance for the explanation of the different resistance level.
Differences between NT-2, NT-2-R and TCam-2 cells were most pronounced in cell cycle modifications and cell death induction. In both NT-2 and NT-2-R cells CDDP incubation resulted in an extended S phase that gave way to a G2/M arrest and finally to apoptosis, measured as an increase in sub-G1 fraction. These effects were more pronounced in NT-2 cells.
Cell death in NT-2 cells was characterized by DNA fragmentation and loss of membrane integrity, but lacking phosphatidyl serine externalisation, a hallmark of apoptosis. TCam-2 cells only showed minor cell cycle modifications after CDDP incubation. In addition, radiation did not result in a cell cycle arrest either. No repair of the radiation-induced DSB was observed. Already, former analyses showed that expression of BRCA1 is associated with CDDP and radio-resistance. This might be due to its modulating effects on apoptosis. BRCA1 was expressed exclusively in TCam-2 cells.
Thus, the observed differences in resistance may be due to altered, suppressed or modulated cell death pathways. An elevated DNA repair seems to be of minor responsibility. Clinical impact of these mechanisms warrants further investigations.

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