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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48375
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4837/


Design and synthesis of a specific inhibitor for the microtubule affinity regulating kinase (MARK)

Design und Synthese eines spezifischen Inhibitors der microtubule affinity regulating kinase (MARK)

Job, Robin

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SWD-Schlagwörter: Alzheimer-Erkrankung , Alzheimer Disease
Basisklassifikation: 35.07
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 29.10.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die genauen Ursachen, die das Absterben von Neuronen im Verlauf der Alzheimer-
Erkrankung bewirken, sind immer noch nicht vollständig aufgeklärt. Von entscheidender
Bedeutung ist die Tatsache, dass die Hyperphosphorylierung von Tau zum Zusammenbruch
des axonalen Transports führt. Dies ist das letzte Glied in der Kette der größtenteils
unbekannten Ursachen, an deren Ende das Absterben von Neuronen steht.
Der entscheidende Punkt, der dazu führt, dass der Phosphorylierungsgrad von Tau nicht mehr
innerhalb der benötigten Parameter reguliert wird, ist die unnatürlich hohe Aktivität der
microtubule affinity regulating kinase (MARK). Gelänge es, diese gesteigerte Aktivität zu
regulieren, ließe sich der axonale Transport in den Neuronen stabilisieren. Ein spezifischer
MARK-Inhibitor wäre dazu in der Lage, die Entstehung des neuronalen Zerfalls zu
verlangsamen und könnte den Ausgangspunkt für eine neue Klasse von Medikamenten
darstellen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welche der aus der Literatur bekannten
bekannten Zielsequenzen von MARK am stärksten an die Kinase binden. Die im Rahmen der
SPR-Experimente erhaltenen Daten zeigten Bindungskonstanten zwischen 1.37 (1, KSR1,
387
LLRTESV393
) und 3.09 mM (3, PTPH1,
387
LLRTESV393
). Die kinetische Auswertung lieferte
deutlich niedrigere KD-Werte zwischen 0.013 (4, repeat 1,
257
KSKIGST263
) und 0.057 mM (2,
Cdc25C,
211
LYRSPSM217
). Große Differenzen in der Affinität konnten in der Untersuchung der
vier repeat-Regionen des Tauproteins festgestellt werden. Die Verlängerung der
ursprünglichen Sequenz um drei Aminosäuren am N-Terminus bewirkte bei den auf dem
ersten und vierten repeat beruhenden Peptiden 8 (repeat 1,
254
KNVKSKIGST263
) und 11
(repeat 4,
348
DRVQSKIGSL357
) eine Affinitätssteigerung von 2.06 (4, repeat 1,
257
KSKIGST263
)
bzw. 1.47 mM (5, repeat 2,
288
KSKCGST294
) auf einen KD-Wert von 0.14 (8, repeat 1,
254
KNVKSKIGST263
) bzw. 0.29 mM (11, repeat 4,
348
DRVQSKIGSL357
). Die beiden inneren
repeats (9, 10) zeigten keine entsprechende Wirkung der weiteren Aminosäuren. Zusätzlich
wurde der Effekt der Phosphorylierung auf die Bindungseigenschaften untersucht. Die zu 4
(repeat 1,
257
KSKIGST263
) und 5 (repeat 2,
288
KSKCGST294
) analogen phosphorylierten Peptide
6 (repeat 1,
257
KSKIG-S(PO4)-T263
) und 7 (repeat 2 ,
288
KSKCG-S(PO4)-T294
) zeigten eine
deutliche Verringerung der Affinität um Faktor 2 (6, repeat 1,
257
KSKIG-S(PO4)-T263
) bzw. 1.5
(7, repeat 2,
288
KSKCG-S(PO4)-T294
). Dies beweist, dass die Zielsequenzen der Kinase nach
erfolgter Umsetzung zum Produkt leicht durch neues Substrat verdrängt werden können.
Die Röntgenkristallstrukturen von MARK zeigen inaktive Konformationen des Proteins.
Während der Kristallisierung dimerisieren je zwei Kinasen über den regulatorischen loop
miteinander, wodurch dieser die Kavität versperrt. Aus dem Vergleich der Strukturen 2HAK
und 1Y8G ging hervor, dass die Aminosäuren Lys
190
bis Pro214
den Hauptteil der
regulatorischen Schleife ausmachen, da sie so flexibel waren, dass sie in 1Y8G nicht aufgelöst
werden konnten. Die Struktur ohne den flexiblen Bereich wurde verwendet, um ATP und ein
Peptid nacheinander in die Kavität zu docken. Zuvor wurde die Nukleotidbindungstasche mit
Hilfe der SYBYL-Routine siteID find pockets identifiziert, wobei Strukturen anderer Kinasen
als Referenz verwendet wurden.
Die resultierende Geometrie zeigte eindeutig den Bereich, in dem die fehlenden Aminosäuren
des loops im Inneren der Kavität verlaufen mussten. Diese wurden anschließend manuell in
das Protein eingeführt. Auf diese Art und Weise wurden drei Modelle kreiert, die sich in
erster Linie im Verlauf der Schleife außerhalb der Kavität unterschieden. Sie spiegeln wieder,
wie sich der loop beim Herausfalten aus dem Protein bewegen könnte. Im Inneren der
Bindungstasche waren die Unterschiede zwischen den Modellen noch gering. In der
Peripherie, wo kaum Wechselwirkungen zwischen Protein und dem wachsenden loop
gegeben waren, zeigten die Modelle in zunehmendem Maß energetische Unterschiede zu den
nativen Vergleichsstrukturen.
Der grundsätzliche Verlauf der modellierten loops deckte sich mit denen verschiedener
nativer Kristallstrukturen. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass die Modelle ein
gutes Abbild der aktiven Konformation von MARK wiedergaben. Die auf diese Weise
erarbeitete Geometrie der binding site wurde genutzt, um im Modell verschiedene linker
zwischen den gebundenen Substraten zu etablieren. Diese überbrückten den Abstand
zwischen dem backbone des gebundenen Peptids und dem N9 des Adenins unter
Berücksichtigung der ermittelten Geometrie. Aus den anschließenden Synthesearbeiten
resultierten zwei Aminosäureanaloga (17 und 23), die erfolgreich in der Festphasensynthese
eingesetzt wurden.
Die Peptide wurden mit einer Länge von 13 Aminosäuren synthetisiert, wobei sich die mit
der modifizierten Aminosäure an Position acht befand. Diese Wahl wurde vor dem
Hintergrund getroffen, dass die Peptide dazu in der Lage sein sollten, den vollständigen
frontalen Bereich der Kinase abzudecken. Die Ergebnisse der SPR-Studien zeigten, dass die
meisten Verbindungen keine nennenswerte Affinität zur Kinase aufwiesen. Die Peptide 55
(repeat 1,
255
NVKSKIG-23-TENLK267
), 63 (Palladin,
505
LLNKRRG-17-VPILR517
) und 64
(Palladin,
505
LLNKRRG-23-VPILR517
) dagegen zeigten gute Bindungseigenschaften. Neben
der SPR-Analyse wurde ein Kinase-Assay angewendet, um die Wirkung der Substanzen in
vitro zu charakterisieren. Die Resultate deckten sich nur teilweise mit denen der SPR-
Versuche. 63 (Palladin, 17) und 66 (Cdc25C V1,
209
SGLYRSP-23-FPENL221
) zeigten mit
einer Inhibitionsrate von rund 30 % den stärksten Effekt auf den Umsatz von MARK.
Allerdings wurde für das zu 63 (Palladin, 17) analoge 64 (Palladin, 23), welches in den SPR-
Experimenten eine stärkere Affinität zu MARK als 63 (63: 350 bzw. 64: 230 µM) gezeigt hat,
keinerlei Effekt festgestellt. Das in vitro sehr effiziente 66 (Cdc25C V1, 23) wiederum zeigte
im Biacore keine Affinität zu MARK.
Diese Substanzen wurden zusätzlich einem FRET-Assay unterzogen, deren Substrat eine
photometrische Verfolgung der Reaktion erlaubte. Die im ersten Test sehr effizienten
Inhibitoren 63 (Palladin, 17) und 66 (Cdc25C V1, 23) zeigten hier mit KD-Werte von 49 (66)
bzw. 340 µM (63) schlechtere Affinität als die anderen Peptide, deren Werte alle zwischen
4.9 (64) und 9.4 (60) µM lagen. Allerdings wurde in diesem Assay auch für 60 (KSR1,
385
ARLRRTE-17-VPSDI
397
), welches aufgrund seiner geringen Affinität im SPR-Test als
Negativkontrolle gewählt wurde, ein KD-Wert von 9.42 µM ermittelt.
Die drei unterschiedlichen Testverfahren lieferten keine übereinstimmenden Ergebnisse.
Während im SPR-Experiment ein System im stetigen Fluss und mit einem anderen
Puffersystem verwendet wurde, war der einzige Unterschied in den Kinase-Assays das zu
phosphorylierende Substrat. Fest steht, dass die synthetisierten Substanzen durchaus
inhibitorisches Potential aufwiesen, wobei die Ergebnisse je nach Testmethode zum Teil
deutliche Abweichungen zeigten. In allen Tests schienen die auf dem Protein Palladin
beruhenden Peptide besonders effiziente Binder zu sein, auch wenn sie im FRET-Assay
ähnliche Werte lieferten, wie die anderen Substanzen.
Um zusätzliche Daten in Bezug auf die Spezifität der inhibitorisch wirksamen Peptide zu
erhalten, wurde ein weiterer auf radioaktiv dotiertem ATP basierender Assay durchgeführt.
Als Vergleichskinase fiel die Wahl auf GSK3β, welche wie MARK ebenfalls Tau
phosphoryliert, allerdings an anderen Positionen. Der Vergleich der Aktivitätsverringerungen
der Kinasen zeigte, dass alle getesteten Substanzen einen stärkeren Effekt bei GSK3β zeigten
als bei MARK.
Zusammenfassend konnten das Design und die Synthese eines inhibitorisch wirksamen
Moleküls erfolgreich umgesetzt werden. Insbesondere die auf dem Protein Palladin
beruhenden Peptide zeigten hohe Affinitäten im SPR-Experiment und bis zu 30 %
Verringerung der Kinaseaktivität bei der Übertragung von radioaktivem Phosphat auf das
Peptidsubstrat TR1 (
255
NVKSKIGSTENLK267
). Allerdings schwanken die Ergebnisse bei
verschiedenen Assays zum Teil recht stark. Jedoch zeigte der Vergleich von MARK und
GSK3β dass die erhoffte Spezifität der Konstrukte nicht im gewünschten Maß realisiert
werden konnte. Zwar bewirken unterschiedliche Aminosäuresequenzen unterschiedliche
Inhibitionsraten bei beiden Kinasen, jedoch konnte keine MARK-spezifische Wirkung
festgestellt werden.
Kurzfassung auf Englisch: The molecular cause which leads to the clinical picture called Alzheimer is in most instances
unknown. One final incident of this chain of events is the collapse of axonal transport. The
crucial point here is that hyperphosphorylation of tau causes the development of
neurofibrillary tangles and as consequence the microtubuli loose their stability. The critical
shortage of essential substances in the synapse causes a complete breakdown of the cell. The
event that leads to the tangles is the high degree of phosphorylation caused by an overactive
microtubule affinity regulating kinase (MARK). A specific inhibitor against MARK that
downregulates the hyperactivity would be able to stabilize axonal transport in neurons. This
could lead to a new class of drug for the treatment of Alzheimer’s disease.
The first part of this work deals with SPR-experiments which should reveal the optimal
sequence for MARK to bind. The peptides were based on different targets of MARK and
showed binding constants between 1.37 (1, KSR1) and 3.09 mM (3, PTPH1). The analysis of
the data by their kinetics revealed constants between 0.013 (4, repeat 1) and 0.057 mM (2,
Cdc25C). A closer look at the repeats showed that the outer repeats benefit from an N-
terminal elongation of three amino acids while this effect is near zero concerning the inner
ones (9, 10). The first and the fourth repeat showed affinities of 0.14 (8, repeat 1) and
0.29 mM (11, repeat 4). To have a closer look at the effect of phosphorylation two
phosphopeptides have been synthesized. The phosporylated analogues of 4 (repeat 1) and 5
(repeat 2; 6 and 7) showed a twofold decrease in affinity. This proofs that the products are
easyly replaced by new educts.
Every available crystal structures of MARK showed inactive conformations. During the event
of chrystallisation the kinases dimerized with the regulatory loop as main dimerization area.
This event positions the loop in front of the cavity and therefore no substrate can enter the
active site. A comparison between the structures 2HAK and 1Y8G revealed that the amino
acids Lys
190
to Pro214
were the main part of the regulatory loop. In the structure 1Y8G they
were so flexible that their positions could not be extrapolated from the crystallographic data.
The structure whithout the loop was used to dock nucleotide and peptide one after the other
into the cavity after the nucleotide binding site has been enlightened by the routine siteID find
pockets using other kinase-structures for comparison. The resulting geometry showed the
space where the loop has to go through. Subsequently the missing amino acids have been
filled in manually. This technique was used to create three different models of MARK which
simulate the processs of the loop folding outwards and clearing the entry to the binding site.
Inbetween the cavity, the models are very similar. But in the peripheral area where very little
contact between loop and the rest of the protein is given differences show up. The comparison
of the models with native chrystal structures revealed that the artificial kinases show a
different energetic behavior. Instead of reaching lower energy values with every additional
amino acid the models exhibit a slight increase which becomes bigger when the loop reaches
the outer area of the protein.
The theoretical progression of the artificial loops harmonises with the ones seen in native
structures of other kinases. Therefore the models can be considered as best possible functional
model of MARK. The geometry of the binding site was used to create different linkers
between the backbone of the substrate and N9 of Adenine. The organic synthesis leads to two
different amino acid analogues (17, 23) which were sucessfully used in solid phase peptide
synthesis.
The chosen length of the peptides was 13 amino acids because this length fits perfectly with
the complete forefront of MARK. Most of the substances didn’t show noteworthy affinities in
SPR-studies. In contrast the peptides 55 (repeat 1, 23), 63 (Palladin, 17) and 64 (Palladin, 23)
showed a relatively high affinity between 230 (64) and 650 (55) µM towards the kinase. An in
vitro assay with radioactive dotated ATP was used as second method to characterise the
potential inhibitors. The results differed from the ones of the SPR-experiments. 63 (Palladin,
17) and 66 (Cdc25C V1, 23) showed the ability to reduce the metabolic rate of MARK by
30 %. Though the homologue to 63 (Palladin, 17; 64), which had an even highter affinity in
the Biacore-experiments (63: 350 respectively 64: 230 µM) than 63 (Palladin, 17) didn’t show
any inhibition here. 66 (Cdc25C V1, 23) as most effective in vitro inhibitor showed no SPR-
activity.
To get another look on the inhibitory effekt a second version of the assay has been conducted.
A special rekombinant substrate allowed the photometric monitoring of the kinase
performance. The effective inhibitors 63 (Palladin, 17) and 66 (Cdc25C V1, 23) showed KD-
Values of 49 (66) respectively 340 µM (63). But the other peptides which were supposed to
show inferiour affinities gave constans between 4.9 (64) and 9.4 (60) µM.
The data of three different test procedures led to divergent results. While the SPR-experiment
worked with a constant flow and another buffer-system the assays just differed in their
substrates. The peptides which had been synthesized with the amino acid analogues 17 and 23
showed definitely inhibitory potential even it differs between the varying tests. Especially the
Palladin-based peptides seemed to be effective inhibitors.
To get data concerning the specifity of the inhibitory effects which are difficult to characterize
a comparison with GSK3β has been conducted. This choice was made because both, MARK
and GSK3β, share Tau as target but recognize different phosphorylation-sites. The results
were not as promising as anticipated. The effects on GSK3β seemed to be even more intense
than the ones on MARK.
In summary the concept of design and synthesis of inhibitory peptides could be carried out
successfully. Besides different results in the applied test procedures have been observed. The
verification of the specifity indicated that the used peptide-sequences did not show the
estimated effect of specific binding.

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