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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48385
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4838/


Identifizierung eines Antimon-Resistenz-Markergens aus Leishmania (Viannia) braziliensis - Vianna, 1911

Nühs, Andrea

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SWD-Schlagwörter: Leishmania brasiliensis , Resistenz , Antimon , Komplementation , Molekulargenetik , Molekularbiologie
Freie Schlagwörter (Englisch): Leishmania braziliensis , antimony , drug resistance , functional cloning , genetics
Basisklassifikation: 42.13 , 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Clos, Joachim (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.09.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 01.11.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Einzellige Protozoen der Spezies Leishmania braziliensis sind die Erreger einer Form der kutanen Leishmaniasis (CL), die sich in vielen Fällen zur entstellenden und lebensbedrohlichen mukokutanen Leishmaniasis (MCL) entwickeln kann.
Zur Behandlung von Leishmania-Infektionen werden seit über 60 Jahren pentavalente Antimon(Sb)-Verbindungen eingesetzt, die bis heute die Therapeutika der Wahl sind. Im Laufe dieser Zeit verzeichneten bestimmte Endemiegebiete einen erheblichen Anstieg von Sb-Therapie-Resistenzen. Fortschreitende Entwicklungen von Sb-Resistenzen in Leishmania, einschließlich L. braziliensis, erfordern eine Entwicklung verlässlicher Resistenzmarker, sowohl um eine adäquate Behandlungen der Leishmania-Infektionen zu gewährleisten als auch zur Entwicklung verbesserter Medikamente und zur epidemiologischen Erfassung bzw. Beobachtung zur Sb-Resistenz beizutragen.

Nach dem Prinzip der Funktionellen Komplementation wurde eine Cosmidbank-DNA aus einem Sb-resistenten L. braziliensis Feldisolat auf Sb-Resistenzmarker hin untersucht. Dabei kamen zwei unterschiedliche Leishmania-Systeme zur Anwendung. Zum einen wurde die Cosmidbank-DNA in ein Sb(III)-sensitives L. braziliensis Feldisolat transfiziert, woraufhin drei unabhängige Sb(III)-Selektionen zu dem selben dominanten Cosmid, pcosC1.6 führten, dessen insert-DNA einen genomischen Bereich auf Chromosom 20 repräsentiert. Zum anderen wurde die gleiche Cosmidbank-DNA in den nahe verwandten Organismus L. peruviana transfiziert, woraufhin die Sb(III)-Selektion zu dem dominanten Cosmid pcosC4-1.28 führte, dessen insert-DNA in genau acht intakten offenen Leserahmen mit pcosC1.6 überlappt.
Um zwischen qualitativen und quantitativen Effekten zu unterscheiden, wurde ein dritter in vitro-Sb(III)-screen durchgeführt, bei dem eine Cosmidbank-DNA aus einem Sb(III)-sensitiven L. braziliensis Feldisolat in den Klon des gleichen, sensitiven Isolats eingebracht wurde. Nach zwei aufeinanderfolgenden in vitro-Sb(III)-Selektionen dominierte das Cosmid pcosA3, das ähnlich wie pcosC4-1.28, in den gleichen acht intakten, offenen Leserahmen mit pcosC1.6 überlappt (Diplomarbeit L. Trübe, Universität Rostock, 2009). Daher handelt es sich bei der beobachteten Resistenz mit hoher Wahrscheinlichkeit um einen dominanten Gendosis-Effekt.
Um den Resistenz-vermittelnden Bereich einzugrenzen wurden systematische Deletionen im Cosmid pcosC1.6 vorgenommen. Funktionstests der Deletionskonstrukte im L. braziliensis-System führten jedoch zu inkonsistenten Daten. Dahingegen konnte im L. infantum-System reproduzierbar auf das in vitro-Sb(III)-Resistenz-vermittelnde Gen LbrM20_V2.0210 (Lb-210) selektiert werden. Das Produkt des Gens ist ein konserviertes, hypothetisches Protein, dessen Funktion bisher nicht bekannt ist. In silico Analysen ermitteln vier repetitive Proteindomänen unbekannter Funktion, DUF1935, die bisher nur innerhalb der Familie der Trypanosomatida gefunden wurden. Ebenso wie Lb-210 verfügt das benachbarte Gen LbrM20_V2.0200 (Lb-200) über vier DUF1935-Domänen, vermittelte jedoch in meinen Untersuchungen keine Sb(III)-Resistenz. Somit können Unterschiede dieser Gene auf mögliche Resistenzmechanismen hinweisen.
Ausgedehnte phylogenetische Untersuchungen und Datenbank-Recherchen beider Sequenzen (Lb-200 und Lb-210) weisen darauf hin, dass der molekulare Resistenzmechanismus vom C-Terminus von Lb-210 ausgeht, wobei insbesondere eine spezifische Sequenz vor der C-terminalen DUF1935-Domäne sowie die C-Terminale DUF1935 selbst impliziert werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit machen deutlich, dass Komplementations-Experimente auch im L. braziliensis-System reproduzierbare Ergebnisse liefern. Dies gilt allerdings nur für lange inserts genomischer DNA (gDNA); einer Verkürzung des gDNA-Anteils führt zu inkonsistenten Ergebnissen. Eine plausible Erklärung für diese Beobachtungen kann eine intakte RNAi-Maschinerie in L. braziliensis sein. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass Untersuchungen der L. braziliensis-Deletionskonstrukte in dem RNAi-freien Organismus L. infantum reproduzierbare und eindeutige Ergebnisse lieferten.

Somit kann die leistungsstarke Methode der Genetischen Komplementation, wenn auch mit Einschränkungen, ebenfalls im potentiell RNAi-fähigen Subgenus Viannia zum Einsatz kommen. Dabei ist darauf zu achten, die endgültige Identifizierung der implizierten Gene in einem möglichst nahe verwandten Organismus durchzuführen, der episomale Expression unterstützt.

Die Analyse von Patienten-Isolaten aus therapieresistenten L. braziliensis-Infektionen zeigte weiterhin, dass es auch in natürlichen Parasiten-Populationen zur teilweise deutlich erhöhten Lb-210-Expression kommt. Somit haben die erzielten Ergebnisse potenziell eine Relevanz für die Resistenz-Ausprägung im Feld.
Kurzfassung auf Englisch: Unicellular protozoa parasites of the species Leishmania braziliensis are the causative agents of cutaneuos and mucocutaneous leishmaniasis.
For more than 60 years pentavalent antimonials have been the first line drugs against Leishmania infections, and have experienced an increase in resistance in important endemic regions. Increasing resistance in the leishmaniae, including L. braziliensis, underscores the urgent need for the development of reliable molecular markers of resistance. This not only to ensure an optimized treatment of the disease but also to support new drug development and epidemiological studies into the spread of antimony resistance.

To this end, a functional cloning strategy was employed. First, a cosmid DNA library dereived from an Sb(III) resistant donor strain was transfected into a Sb(III)-sensitive acceptor clone. Repeated selections of the recombinant population under Sb(III) pressure yielded the same cosmid, pcosC1.6. Its genomic DNA insert corresponds to a region on chromosome 20. Also, the same cosmid library was used to transfect the closely related species L. peruviana. The subsequent Sb(III) selections produced a single dominant cosmid, pcosC4-1.28, which overlaps pcosC1.6 in eight open reading frames, implicating the same region on chromosome 20.
To distinguish between qualitative (i.e. sequence variation) and quantitative (i.e. gene dosis) effects, a third Sb(III) screen was performed in which a cosmid library taken from the Sb(III)-sensitive donor was transfected into the same sensitive L. braziliensis clone. Two consecutive screens revealed a single dominant cosmid, pcosA3, which again overlaps with the previously identified region on chromosome 20. We conclude that the observed resistance is a dominant gene dosis effect.
To identify the resistance mediating region, systematic deletions were performed on pcosC1.6. Screens using these deletion constructs in the L. braziliensis system yielded inconsistent data, while identical screens using L. infantum as acceptor species identified one gene, LbrM20_V2.0210 (Lb-210), which reproducibly confers in vitro Sb(III) resistance. The product of this gene is described as a conserved, hypothetical protein of unknown function. In silico analyses revealed four protein domains of unknown function, DUF1935, unique to the family of Trypanosomatida. Similar to Lb-210 the neighboring gene LbrM20_V2.0200 (Lb-200) also shows four DUF1935 domains but did not confer Sb-resistance in my screens. Hence differences between these genes may point at the structures for resistance and possibly at the mechanisms.
The results of extensive phylogenetitic analyses and database searches of both sequences (Lb-200 and Lb-210) implies that resistance is determined in the C-terminal sequence of Lb-210, in particular in the fourth DUF1935 domain and the divergent sequence between the third and fourth DUF1935.

The results of this work show that complementation genetics can be applied to the L. braziliensis-System and yield reproducible results, when long inserts of genomic DNA (gDNA) are used; short gDNA inserts result in inconsistent data. One plausible explanation for this be the newly discovered RNAi-machinery of L. braziliensis. This explanation is corroborated by the clear-cut data obtained in the RNAi-free acceptor species L. infantum. Consequently the powerful methodology of functional cloning can be used in the RNAi-competent Viannia subgenus with some restrictions. Care should be taken to perform the final identification of the selected genes using a related acceptor organism, which supports episomal expression.

An analysis of L. braziliensis-isolates from L. braziliensis infections revealed that natural parasite populations, too, can show a significant Lb-210 overexpression. In three cases, treatment failure coincided with increasing expression levels. We conclude that variations of Lb-210 expression occur within natural populations and may be associated with a resistance phenotype.

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