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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48525
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4852/


Untersuchung der proteolytischen Prozessierung von humanen Urotensin-Peptiden

Investigation of the proteolytic processing of human urotensin peptides

Trusch, Maria

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SWD-Schlagwörter: Proteasen, LC-MS, Massenspektrometrie, Peptidhormon
Freie Schlagwörter (Deutsch): Urotensin-II , Plasma-Kallikrein , Komplementfaktor I
Freie Schlagwörter (Englisch): Proteases , urotensin-II , plasma kallikrein , mass spectrometry, peptide hormone
Basisklassifikation: 35.26 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.08.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 16.11.2010
Kurzfassung auf Deutsch: Die Ziele dieser Arbeit waren die Verifizierung der Urotensin-II-generierenden (UCE-) Aktivität des Komplementfaktor I (CFI), die Überprüfung deren physiologischer Relevanz sowie die Identifizierung möglicher inaktiver Vorläuferpeptide, die als physiologische Substrat dienen könnten. Innerhalb der Arbeit wurde zudem eine weitere Protease mit UCE-Aktivität, das Plasma-Kallikrein, identifiziert, auch diese Entdeckung wurde hinsichtlich ihrer physiologischen Relevanz hin untersucht.
Die UCE-Aktivität des CFI konnte in verschiedenen gereinigten Proteinfraktionen gezeigt werden. Eine rekombinant exprimierte Mutante mit deutlich verringerter Aktivität gegenüber dem bekannten CFI-Substrat C3b zeigte auch gegenüber dem verwendeten Urotensin-Substrat deutlich niedrigere Aktivität, was die UCE-Aktivität des CFI in vitro untermauert. Auch das Plasma-Kallikrein zeigte eine deutliche UCE-Aktivität und zudem eine sehr schnelle Umsetzung des Substrats. Zur Überprüfung der physiologischen Relevanz wurden verschiedene Patientengruppen auf ihre UCE-Aktivität im Plasma untersucht, darunter CFI-defiziente Patienten, welche keine verringerte, sondern leicht erhöhte UCE-Aktivität aufweisen. Das Plasma dialysepflichtiger Patienten zeigte nach der Dialyse erhöhte UCE- aber verringerte C3b-abbauende Aktivitäten. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass physiologisch neben dem CFI weitere Urotensin-II-generierende Proteasen wie beispielweise das Plasma-Kallikrein agieren und vermutlich den größeren Anteil an der UII-Generierung tragen. Der Anteil des Plasma-Kallikreins an der UII-Generierung im Plasma wurde über einen spezifischen Inhibitor getestet. Die UCE-Aktivität konnte in Anwesenheit dieses Inhibitors deutlich gesenkt werden, was für eine physiologische Relevanz der UCE-Aktivität des Plasma-Kallikreins spricht.
Des Weiteren konnte innerhalb dieser Arbeit ein 30 Aminosäuren langes Fragment des Urotensin-Vorläuferproteins als mögliches Vorläuferpeptid und Substrat für eine Urotensin-II-generierende Protease identifiziert werden. Sowohl der CFI als auch das Plasma-Kallikrein waren in der Lage, dieses Peptid ohne Cofaktoren zu Urotensin-II umzusetzen, wobei das Plasma-Kallikrein eine deutlich schnellere Kinetik aufwies.
Die gewonnenen Ergebnisse bestätigen die UCE-Aktivität des CFI in vitro, konnten jedoch keinen Aufschluss darüber geben, ob diese Aktivität auch von physiologischer Relevanz ist. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierte UCE-Aktivität des Plasma-Kallikreins dagegen scheint auch physiologisch von Bedeutung. Damit gibt es neben den zwei bekannten Peptidhormon-Systemen, dem Kinin-Kallikrein-System und dem Renin-Angiotensin-System, eine weitere proteolytische Aktivität des Kallikreins, welche im Kontext der Blutdruckregulierung von Bedeutung ist.
Kurzfassung auf Englisch: The aims of this work were to validate the Urotensin-II converting (UCE-) activity of the complement factor I (CFI), to test the physiological relevance of this activity and to identify candidates for inactive precursor peptides that could serve as physiological substrates for the UCE. Within this work, a second protease with UCE activity, Plasma Kallikein, was identified. This activity has subsequently also been evaluated towards its physiological relevance.
The UCE activity of CFI was shown in several protein fractions obtained by different purification strategies. A recombinantly expressed mutant with a decreased activity towards the well-known CFI substrate C3b also showed a decreased UCE activity which underlines the UCE activity of CFI in vitro. Plasma Kallikrein also showed a considerable UCE activity and furthermore a very fast turnover of the substrate. The blood plasma of several patient groups was tested towards their UCE activity, among them also patients with a functional CFI deficiency. CFI deficient patients did not show a decrease but a slight increase in their UCE activity. Plasma proteins of patients on hemodialysis showed an increase in their UCE activities after dialysis but a decrease in their C3b-degrading activities compared to the activities before hemodialysis. These results indicate that in vivo proteases other than CFI, e.g. Plasma Kallikrein, act as Urotensin-II generating proteases and might even be physiologically more important than the UCE activity of CFI. The contribution of Plasma Kallikrein to the generation of UII in plasma was tested using a specific inhibitor. In the presence of the inhibitor, the UCE activity was considerably reduced, indicating the physiological relevance of the UCE activity of Plasma Kallikrein.
Furthermore, within this work a 30 amino acid long fragment of the urotensin-II precursor protein was identified as a potential inactiv precursor peptide and substrate for the Urotensin-II converting protease. Both CFI and Plasma Kallikrein were able to convert this peptide into Urotensin-II with Plasma Kallikein showing a much faster kinetic.
The obtained results confirm the UCE activity of CFI in vitro but could not give an indication of its physiological relevance. In contrast, the newly identified UCE activity of Plasma Kallikrein seems to have a physiological relevance. Therefore an additional proteolytic activity of Plasma Kallikrein beside the two already known peptide hormone systems, the Kinin-Kallikrein system and the Renin-Angiotensin system could be shown, being of vital importance in the regulation of blood pressure.

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