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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48822
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4882/


Die strukturelle und funktionelle Charakterisierung der ADP-Ribosylierung von humanem Tumor-Nekrose-Faktor durch

The structural and functional characterization of the ADP-ribosylation of human tumor-necrosis-factor by ADP-ribosyltransferase-1

Laing, Sabrina

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Basisklassifikation: 44.45
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Haag, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.10.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 07.12.2010
Kurzfassung auf Deutsch: ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) können die Funktion von Proteinen modulieren, indem sie ADP-Ribose von Nikotinamid-Adenindinukleotid (NAD) auf einen spezifischen Aminosäure-Rest ihres Zielproteins übertragen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das humane Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ein Zielprotein der humanen ART1 ist, und dass die ADP-Ribosylierung von TNF dosisabhängig sowohl die Bindung an seine Rezeptoren als auch seine biologischen Funktionen beeinflusst.
Die Modifikation hemmte die Bindung von TNF an beide TNF-Rezeptoren (TNFRs) in verschiedenen experimentellen Systemen. Dabei waren Stärke und Rezeptorselektivität des Effekts in den einzelnen untersuchten Systemen stark vom Kontext der Rezeptor/Liganden-Interaktion abhängig. Ebenso hemmte die ADP-Ribosylierung die biologischen Wirkungen von TNF auf Zielzellen, wie den Zelltod, die Aktivierung primärer humaner Granulozyten, und, als molekulares Korrelat seiner Aktivität, die Aktivierung des NF-B-Signalweges.
In Bezug auf zwei der untersuchten TNF-Effektorfunktionen, den TNF-induzierten Zelltod einer humanen T-Lymphom-Zelllinie, sowie die Induktion des CD62L-Sheddings auf Granulozyten, zeigte die ADP-Ribosylierung unterschiedliche Auswirkungen: niedrige NAD-Konzentrationen (4 µM) hemmten den Zelltod, ließen aber das CD62L-Shedding unbeeinflusst. Diese beiden Effektorfunktionen zeigten auch beim Einsatz von anti-TNF-Rezeptor-Antikörpern unterschiedliche Reaktionsmuster. Sowohl TNFR1- als auch TNFR2-spezfische Antikörper hatten eine vorwiegend antagonistische (TNF-blockierende) Wirkung auf den Zelltod, jedoch eine starke agonistische Wirkung auf das CD62L-Shedding. Diese Beobachtungen zeigen, dass beide TNF-Rezeptoren an der Vermittlung beider Effektorfunktionen beteiligt sind, und deuten darauf hin, dass die Wirkung der ADP-Ribosylierung von TNF nicht rezeptorspezifisch ist, sondern vom zellulären Kontext, in dem die Interaktion von TNF mit seinen Rezeptoren stattfindet, abhängt.
Durch massenspektrometrische Untersuchungen wurden zwei Arginine, R6 und R32, als ADP-Ribosylierungsstellen im TNF identifiziert. Mutationsanalysen bestätigten die Identität dieser beiden Zielarginine, zeigten jedoch die Existenz mindestens einer weiteren ADP-Ribosylierungsstelle auf. Untersuchungen mit TNF-Mutanten zeigten, dass die Mutation von R32 zu Lysin die Bindung an TNFR2 sowie die Funktionen von TNF beeinflusste, und dass die ADP-Ribosylierung an der Position 32 für die Wirkung auf das TNF-induzierte CD62L-Shedding funktionell relevant ist.
Die ADP-Ribosylierung stellt einen bisher unbekannten, vielschichtigen Mechanismus zur Regulation des TNF/TNFR-Systems dar. Die vorgelegte Arbeit legt den Grundstein für weitere Untersuchungen, in denen es darauf ankommen wird, die biologischen Situationen zu definieren, in denen dieser Regulationsmechanismus wirksam wird.
Kurzfassung auf Englisch: ADP-ribosyltransferases (ARTs) modulate the function of proteins by transferring an ADP-ribose moiety from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to a specific amino acid residue of a target protein. This thesis shows that the human cytokine tumor necrosis factor (TNF) is a target protein for ADP-ribosylation by human ART1, and that this modification affects the binding of TNF to its receptors and its biological functions in a dose-dependent manner.
The modification blocked the binding of TNF to both TNF-receptors (TNFRs) in different experimental systems. The intensity of the effects and their receptor selectivity differed in the experimental sytems investigated, and were highly dependent on the context of the receptor/ligand interaction. In addition, ADP-ribosylation blocked the biological effects of TNF on target cells, such as cell death, the activation of primary human granulocytes, and, as a molecular correlate of its activity, the activation of the NF-B signalling.
ADP-ribosylation showed different effects on two functions of TNF, the induction of cell death in a human T-lymphoma cell line and the induction of CD62L-shedding on granulocytes, in that low concentrations of NAD (4 µM) blocked cell death, but left CD62L-shedding unaffected. These two functions were affected differently by anti-TNF-receptor-specific antibodies. Both TNFR1- and TNFR2-specific antibodies had predominantly antagonistic effects on cell death, but highly agonistic effects on CD62L-shedding. These observations show that both TNF-receptors are involved in mediating both effector functions, and suggest that the effects of ADP-ribosylation of TNF are not receptor-specific, but depend on the cellular context in which the interaction of TNF with its receptors takes place.
Two arginines, R6 and R32, were identified as ADP-ribosylation sites in TNF by mass spectrometry. Mutational analysis confirmed the identity of these two target arginines, but showed the existence of at least one more ADP-ribosylation site.
The conservative mutation of R32 to lysin affected both the binding of TNF to TNFR2 and its functions. In addition, it was shown that ADP-ribosylation of R32 is necessary and sufficient for the effect of the modification on TNF-induced CD62L-shedding.
ADP-ribosylation constitutes a so far unknown, complex mechanism for the regulation of the TNF/TNFR system. This dissertation lays the foundation for further investigations to define the biological situations, in which this regulatory mechanism may be effective.

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