Alterations of host cell physiology in the late phase of Plasmodium hepatocyte infection

Abstract

Malaria is one of the top three infectious diseases in the developing world. It is mostly restricted to tropical and subtropical regions and causes up to 500 million infections and 2 million deaths per year. The infectious agent that causes Malaria is the protozoan parasite Plasmodium, which is transmitted by female Anopheles mosquitoes during a blood meal. After inoculation into the vertebrate host the parasite migrates to the liver and develops within hepatocytes before it is shuttled into the blood stream within vesicles termed merosomes. Once released from these merosomes, the parasite infects erythrocytes and causes symptoms of disease. Since the parasite load is low during the apathogenic liver stage, this step of the life cycle is a convenient time period for eradication of the parasite. However, many aspects of liver stage development are still unknown. Here, live cell imaging was employed to follow parasite and host cell structures and organelles during liver stage development and to understand how they interconnect and change. Initially, a novel red-fluorescent parasite expressing mCherry was generated. It was demonstrated that mCherry is bright and photostable when expressed in P. berghei and that it can be used for long- term imaging without photodamage. Using this parasite strain, it was for the first time possible to record the entire P. berghei liver stage development from sporozoite invasion to merosome formation in long-term live imaging studies. An array of other fluorescent parasite strains was then generated and used to identify the origin of the membrane surrounding merosomes and to understand the changes in host cell physiology during the late liver stage. The three membranes that the merosome membrane could originate from - parasite membrane, membrane of the parasitophorous vacuole (PVM) and host cell membrane - were examined in turn. This revealed that the parasite membrane invaginates to become the merozoite membrane and that the PVM disintegrates once merozoite formation is completed. The host cell membrane, in contrast, stays intact for several hours and forms the membrane of the detached cell and of merosomes. Once the PVM has broken down, the host cell is altered profoundly. The mitochondrial network disintegrates and most likely releases apoptotic factors. Nevertheless, the resulting death of the host cell differs from the normal apoptotic program. While protein biosynthesis is arrested and the turnover rate appears to slow down, phosphatidylserine asymmetry is retained, protecting the newly formed merozoites from the attack of phagocytes. It is proposed that the observed phenotype of detached cells is due to a premature termination of the apoptotic program because of the depletion of energy within the cell. The dismantling of the host cell under retention of the sheltering membrane hereby simultaneously marks the final step in the exploitation of the host hepatocyte by the Plasmodium parasite and the first step towards the blood stage.

Malaria ist eine der am weitesten verbreiteten Infektionskrankheiten der Entwicklungsländer. Zu den endemischen Gebieten zählen vor allem tropische und subtropische Regionen, in denen es zu etwa 500 Millionen Infektionen und 2 Millionen Todesfällen pro Jahr kommt. Der verantwortliche Erreger ist der einzellige Parasit Plasmodium, der während der Blutmahlzeit von weiblichen Anopheles-Mücken übertragen wird. Nach der Inokulation in den Wirbeltierwirt wandert der Parasit zur Leber und entwickelt sich in Hepatozyten, bevor er in Vesikeln, den sogenannten Merosomen, in den Blutstrom transportiert wird. Sobald der Parasit aus diesen Merosomen entlassen wird, infiziert er Erythrozyten und erste Krankheitssymptome treten auf. Da die Parasitenlast im symptomfreien Leberstadium gering ist, bietet sich dieser Abschnitt des Lebenszyklus zur Bekämpfung der Erkrankung an. Viele Aspekte des Leberstadiums sind allerdings noch unbekannt. Hier wurde der Ansatz der Lebendzell-Beobachtung gewählt, um Strukturen und Organellen des Parasiten und der Wirtszelle durch das Leberstadium hindurch zu verfolgen und zu verstehen wie sie sich verändern und voneinander abhängig sind. Zunächst wurde ein neuer rot-fluoreszierender Parasitenstamm generiert, der mCherry exprimiert. Es wurde gezeigt, dass mCherry bei Expression in P. berghei hell fluoresziert, photostabil ist und für Langzeitexperimente verwendet werden kann, ohne phototoxisch zu sein. Unter Verwendung dieses Parasitenstammes war es unter anderem das erste Mal möglich, die gesamte Leberstadienentwicklung von P. berghei in einer Langzeit-Lebendzellbeobachtung aufzuzeichnen, beginnend mit der Invasion der Sporozoiten und endend mit der Bildung von Merosomen. Anschließend wurde eine Auswahl weiterer fluoreszierender Parasitenstämme generiert, um den Ursprung der Membran zu klären, die die Merosomen umgibt, und um die Veränderungen in der Physiologie der Wirtszelle während des späten Leberstadiums zu verstehen. Die drei Membranen, aus denen die Merosomenmembran entstehen könnte - Parasitenmembran, Membran der parasitophoren Vakuole (PVM) und Wirtszellmembran - wurden nacheinander untersucht. Dies zeigte, dass die Parasitenmembran sich einstülpt und zur Merozoitenmembran wird und dass die PVM sich auflöst sobald die Merozoitenbildung abgeschlossen ist. Im Gegensatz dazu bleibt die Wirtszellmembran für mehrere Stunden intakt und bildet die Membran der abgelösten Zellen und Merosomen. Sobald die PVM zusammengebrochen ist, verändert sich die Wirtszelle erheblich. Das mitochondriale Netzwerk disintegriert und entlässt höchstwahrscheinlich proapoptotische Faktoren. Nichstdestotrotz unterscheidet sich der resultierende Wirtszelltod von einer normalen Apoptose. Während die Proteinbiosynthese zum Stillstand kommt und sich Austauschprozesse verlangsamen, bleibt die Phosphatidylserin-Asymmetrie erhalten. Dies schützt die neu gebildeten Merozoiten vor einem Angriff durch Phagozyten. Es wird vermutet, daß der beobachtete Phänotyp der abgelösten Zellen durch einen frühzeitigen Abbruch des apoptotischen Programms in Folge einer Erschöpfung der Energievorräte der Zelle zustande kommt. Die Demontage der Wirtszelle unter Erhalt der schützenden Membran stellt hierbei gleichzeitig den letzten Schritt in der Ausbeutung des Wirts-Hepatoyzten durch den Plasmodium-Parasiten und den ersten Schritt zum Blutstadium dar.