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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-49808
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/4980/


Analysen zur Funktion von Drosha und der durch das Kaposi Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) kodierten microRNAs während der viralen Latenz

Functional analysis of Drosha and KSHV-encoded microRNAs during viral latency

Christalla, Thomas

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SWD-Schlagwörter: Kaposi-Syndrom , Latenz , Small RNA
Freie Schlagwörter (Deutsch): KSHV , Kaposi Sarkom-assoziiertes Herpesvirus , microRNA , miRNA , Drosha
Basisklassifikation: 44.75
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.08.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 02.02.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Das Kaposi Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist mit drei lymphoproliferativen Tumorerkrankungen in immunsupprimierten Individuen assoziiert: dem Kaposi Sarkom (KS), dem primären Effusionslymphom (PEL) sowie der Multizentrischen Castleman Krankheit (MCD). In allen Tumorzellen, wie auch in PEL und in von PEL-abgeleiteten Zelllinien, persistiert das KSHV in seiner latenten Infektionsform. Diese Phase des viralen Lebenszyklus ist durch die eingeschränkte Expression einiger weniger viraler Gene charakterisiert, welche eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Progression von KSHV-assoziierten Erkrankungen spielen. Im Gegensatz dazu, bezieht die lytische Replikation die zeitlich regulierte Expression des nahezu gesamten viralen Genoms ein und führt letztendlich zum Tod der infizierten Wirtszellen und der Freisetzung neuer Viruspartikel. Aus diesem Grund ist die Suppression der produktiven KSHV Replikation entscheidend für die Proliferation von Tumor-zellen. Die genauen molekularen Mechanismen, welche zur Aufrechterhaltung der Latenz beitragen, sind bis heute noch weitestgehend ungeklärt. Von besonderem Interesse sind hierbei die durch unsere und andere Gruppen identifizierten KSHV-kodierten miRNAs. MiRNAs sind kleine (~22 nt), nicht-kodierende RNAs, welche durch Bindung an ihre Ziel-mRNA zu einer post-transkriptionellen Regulation der Genexpression befähigt sind. Aufgrund ihrer konstitutiven Expression in latent infizierten Zellen stehen die KSHV-kodierten miRNAs im Verdacht, zur Aufrechterhaltung der viralen Latenz sowie durch eine Modulation der zellulären Genexpression zur Tumorprogression beizutragen.
Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde im Rahmen dieser Arbeit die Expression von Drosha und Dicer, zweier Schlüsselenzyme der miRNA-Reifung, mit Hilfe der RNA-Interferenz Technik inhibiert. Die Inhibition der beiden Enzyme resultierte in einer deutlichen und in etwa gleichstarken Reduktion der virusspezifischen miRNA Expression. Interessanterweise konnte nach Suppression von Drosha eine rasche und effiziente Induktion der lytischen KSHV Reaktivierung in latent infizierten PEL-Zelllinien nachgewiesen werden, während die Suppression von Dicer keine Auswirkung auf die Induktion des lytischen Zykluses zeigte. Somit scheint ein miRNA-unabhängiger Mechanismus für den beobachteten Phänotyp verantwortlich zu sein. Eine erst kürzlich gemachte Beobachtung lässt vermuten, dass Drosha direkt an der Destabilierung von mRNA Transkripten beteiligt ist. Durch die Anwendung von umfassenden DNA-Microarray Analysen konnten hierbei mehrere zelluläre mRNA Transkripte identifiziert werden, welche nach Suppression von Drosha stark hochreguliert waren. Die Transkripte PLAU (Urokinase Plasminogen Aktivator) und CCL3 (C-C Chemokin Ligand 3) waren in den Analysen am stärksten reguliert, so dass ihre Rolle während der latenten Infektionsform von KSHV näher untersucht wurde. Wie sich zeigte, konnte durch eine lentivirale Überexpression von CCL3 kein induzierender Effekt auf die Initiation des lytischen Zyluses in PEL-Zellen nachgewiesen werden. Eine mögliche Rolle von PLAU während der viralen Latenz konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Eine Regulation dieser Transkripte durch Drosha wird derzeit untersucht. Um weitere Hinweise auf den Zusammenhang zwischen der Suppression von Drosha und der viraler Reaktivierung zu erhalten wurden des Weiteren Proteomanalysen durchgeführt und dadurch Proteine identifiziert, die für den nach Suppression von Drosha induzierten Phänotyp verantwortlich sein könnten. Die Daten dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass die präzise Kontrolle von Drosha, unabhängig von seiner Funktion in der miRNA-Biogenese, an der Aufrechterhaltung der latenten Infektionsform von KSHV beteiligt sein könnte.

Ein weiterer Teil dieser Arbeit bestand in der Identifizierung von zellulären Zieltranskipten KSHV-kodierter miRNAs. Es ist in dieser Arbeit gelungen humane B-Zellen mit einer stabilen Expression der KSHV-kodierten miRNAs zu generieren, deren mRNA Expressionsprofil anhand von DNA-Microarray Analysen untersucht wurde. Dabei zeigte sich, dass durch die ektopische Expression der KSHV-kodierten miRNAs überwiegend mRNA Transkripte des Interferon-Systems negativ reguliert waren. Durch die Anwendung von Proteomanalysen konnten zudem weitere potentielle miRNA Zieltranskripte identifiziert werden, welche derzeit verifiziert werden. Die Daten dieser Arbeit liefern erste Hinweise, dass die virusspezifischen miRNAs durch die Modulation des Immunsystems zur Aufrechterhaltung der latenten Infektionsform beitragen könnten.

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