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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-50053
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5005/


Identification and Analysis of microRNAs Encoded by gamma-Herpesviruses

Identifizierung und Analyse von gamma-Herpesvirus kodierten microRNAs

Walz, Nicole

Originalveröffentlichung: (2010) Walz, N., Christalla, T., Tessmer, U., and Grundhoff, A. (2010). A global analysis of evolutionary conservation among known and predicted gammaherpesvirus microRNAs. J Virol 84, 716-728.
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SWD-Schlagwörter: Epstein-Barr-Virus
Freie Schlagwörter (Deutsch): miRNA, Herpesvirus, Rhesus Lymphocryptovirus, Rhadinovirus, DNA-Mikroarray
Freie Schlagwörter (Englisch): miRNA, Herpesvirus, Rhesus Lymphocryptovirus, Rhadinovirus, DNA-Microarray
Basisklassifikation: 42.13 , 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.01.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 11.02.2011
Kurzfassung auf Englisch: More than 90% of adults are estimated to be infected with the Epstein-Barr virus (EBV). EBV is not only the aetiologic agent of infectious mononucleosis (IM), but is also associated with different kinds of tumors like Burkitt’s lymphoma or nasopharyngeal carcinoma. However, the precise contribution of EBV to tumorigenesis is only partially understood. The virus persists as a benign latent infection throughout the host’s lifetime. Gene expression during latency is strictly limited to very few genes. However, all viral miRNAs are expressed in latency. Mature miRNAs are small, non-coding RNAs
(~ 21 nt) derived from a pre-miRNA hairpin. Mature miRNAs are incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC) and bind imperfectly to the 3’UTR of target mRNAs to silence post transcriptionally gene expression. Since miRNAs require minimal coding capacity and are non-immunogenic, they are a useful tool for herpesviruses to modulate host cell gene expression. Thus, an important function in the herpesviral life cycle has been proposed.
When this work was started, the miRNA registry listed 146 viral miRNAs, the vast majority (139) of which are encoded by herpesviruses. There is little evidence of evolutionary conservation, except for seven miRNA hairpins shared between EBV and the closely related rhesus lymphocryptovirus (rLCV). Assuming that viral miRNAs have important functions, it was hypothesized that more conserved miRNAs may exist. Therefore, the conservation state of all known and predicted gamma-herpesvirus encoded miRNAs was investigated. Pre-miRNA hairpins were predicted with a recently established program VMir. VMir allows the ab initio prediction of pre-miRNA hairpins in viral genomes. A subsequent BLAST alignment of viral sequences allowed the identification of conserved miRNAs. In this work, it was shown that γ-herpesvirus miRNAs are encoded in clusters at the same genomic positions. In contrast to the conserved genomic position, the sequences were mostly not conserved. One of two exceptions is presented by EBV and rLCV, which were predicted to encode a significantly higher number of conserved miRNAs. The second exception was found in the rhadinoviruses, rhesus rhadinovirus (RRV) und Japanese monkey herpesvirus (JMHV). Northern blotting confirmed 2, 17 and 14 novel EBV-, rLCV- and JMHV-miRNAs, respectively. The number of partial conserved miRNAs of EBV and rLCV was significantly higher than previously thought. Nearly all of the pre-miRNAs encoded by the closely related RRV and JMHV are conserved.
At the beginning of this work, nearly nothing was known about EBV-encoded miRNA targets and functions. The computational target prediction is very difficult due to the fact that miRNAs bind imperfectly to their target mRNAs. To elucidate functions of EBV-encoded miRNAs, DNA and adenoviral expression vectors that allow simultaneous expression of all EBV-encoded miRNAs were generated. Since miRNAs not only inhibit translation but also destabilize their target mRNAs, gene expression microarrays were used to identify EBV-miRNA targets. Differentially regulated genes were filtered for miRNA binding sites and verified in luciferase reporter assays. A set of putative target mRNAs was identified, including myxovirus resistence 1 (MX1). In line with this, preliminary data point toward a reduced IFN signaling in response to miRNA expression in primary cells. Thus it can be proposed that EBV-encoded miRNAs might directly influence the IFN pathway. Tankyrase 2 (TNKS2) was also verified in luciferase assays. Overexpression of TNKS2 has been shown to inhibit EBV episome replication. A miRNA dependent reduction of TNKS2 might be responsible for a facilitated replication of the episome. These data indicate that EBV-encoded miRNAs might create an advantageous environment, allowing replication and maintenance of the EBV genome by interfering with different cellular networks.
Kurzfassung auf Deutsch: Mehr als 90% der Weltbevölkerung sind mit dem Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert. Das Virus ist mit diversen Tumorerkrankungen wie z.B. dem Burkitt’s Lymphom oder dem Nasopharynxkarzinom assoziiert. Die Rolle, die das Virus in der Tumorentstehung spielt, ist dabei nur unzureichend verstanden. Das EBV Genom wird als episomale DNA in der Wirtszelle latent repliziert. In dieser Phase werden nur wenige Proteine, aber alle viralen microRNAs (miRNAs) exprimiert. MiRNAs sind kleine, nicht kodierende RNAs, die post-transkriptionell Genexpression regulieren. MiRNAs werden aus Vorläufermolekülen, den pre-miRNAs, die eine charakteristische Haarnadelschleifenstruktur aufweisen, in ~21 nt lange reife miRNAs prozessiert. Reife miRNAs werden in den „RNA induced silencing complex“ (RISC) inkorporiert und binden meistens nicht vollständig komplementär an die 3’UTR von Ziel-mRNAs, was zur Inhibition der mRNA-Translation führt. MiRNAs sind nicht immunogen und benötigen wenig kodierende Kapazität. Daher stellen sie ideale Werkzeuge für Herpesviren dar, um die Expression des Wirtsgenoms zu modulieren.
Zu Beginn dieser Arbeit waren in der miRNA Datenbank (miRBase) 146 virale miRNA registriert, von denen die große Mehrheit (139) von Herpesviren kodiert wird. Es wird allgemein angenommen, dass virale miRNAs eine wichtige Rolle im herpesviralen Lebenszyklus und der Tumorentstehung spielen. Diese Annahme ließ vermuten, dass virale miRNAs zwischen verschiedenen Viren konserviert sind, um dieselben Funktionen auszuüben. Unter den bislang bekannten miRNAs wurden aber wenige konservierte Vertreter gefunden, mit der Ausnahme von 7 miRNAs von EBV und dem nahe verwandten Rhesus Lymphocryptovirus (rLCV). Daher wurde in dieser Arbeit erstmals eine globale miRNA-Analyse aller komplett sequenzierten γ-Herpesviren durchgeführt. Ein kürzlich etabliertes Programm (VMir) wurde für die ab initio Vorhersage von pre-miRNAs in viralen Genomen verwendet. Unter Verwendung des BLAST-Algorithmus wurden nachfolgend konservierte pre-miRNAs identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass viele gamma-Herpesviren miRNA-Cluster an denselben genomischen Positionen kodieren. Weiterhin zeigte sich, dass die Sequenzen der miRNAs, im Gegensatz zu der genomischen Position, in der Regel nicht konserviert waren. Eine von zwei Ausnahmen stellten EBV und rLCV dar, für welche wesentlich mehr konservierte pre-miRNAs als bisher bekannt vorhergesagt wurden. Die zweite Ausnahme bildeten die zu den Rhadinoviren gehörenden Rhesus Rhadinovirus (RRV) und Japanese Monkey Herpesvirus (JMHV). In Northern Blot-Analysen wurden 2 neue EBV-, sowie 17 neue rLCV- und 14 neue JMHV-miRNAs identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl partiell konservierter miRNAs zwischen EBV und rLCV signifikant größer ist als bisher angenommen und dass zwischen den näher verwandten Viren RRV und JMHV nahezu alle pre-miRNAs konserviert sind.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Ziel-mRNA Identifizierung von EBV-kodierten miRNAs. Die computerbasierte Vorhersage von Ziel-mRNAs ist aufgrund der nicht vollständig komplementären Bindung der miRNA äußerst schwierig. Um die Funktion von EBV kodierten miRNAs in biologischen Systemen zu untersuchen, wurden Expressionsplasmide und adenovirale Vektoren generiert, welche für alle EBV-miRNAs kodieren. Da miRNAs neben der translationalen Inhibierung auch eine Destabilisierung der Ziel-mRNA bewirken, wurden die Transkriptome von miRNAs stabil exprimierenden Zelllinien und infizierten primären Zellen mittels Expressions-Mikroarrays analysiert. So ermittelte potentielle Ziel-mRNAs wurden dann mit Hilfe computerbasierter Programme hinsichtlich möglicher miRNA-Bindungsstellen weiter eingegrenzt. Der Nachweis einer direkten Bindung der miRNA an ihre Ziel-mRNAs erfolgte mittels Luziferase-Assay. Es konnten so einige potentielle Ziel-mRNAs identifiziert werden, unter anderem die des Interferon-induzierten Proteins myxovirus resistance 1 (MX1). In diesem Zusammenhang weisen preliminäre Analysen auf eine verringerte IFN-Antwort in miRNA exprimierenden Zellen hin, so dass EBV kodierte miRNAs möglicherweise direkt in die Interferon-Antwort eingreifen. Weiterhin wurde Tankyrase 2 (TNKS2) im Luziferase-Assay verifiziert. Überexpression von TNKS2 führt zur Inhibition der latenten Replikation des EBV-Episoms. Eine verringerte Expression von TNKS2 könnte somit für eine effizientere Replikation des Episoms verantwortlich sein.
Diese Daten weisen darauf hin, dass EBV kodierte miRNAs durch Eingreifen in unterschiedliche zelluläre Netzwerke eine für die Replikation des Virus und den Erhalt des Episoms optimale Umgebung schaffen könnten.

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