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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-50360
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5036/


Crystallographic structure analysis of selected pharmaceutically important plant compounds and protein complexes

Kristallstruktur Analyse ausgewählter pharmazeutisch wichtigen Pflanzenstoffe und Protein-Komplexe

AKREM, AHMED

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Basisklassifikation: 35.25
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.02.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 01.03.2011
Kurzfassung auf Englisch: Protective plant proteins specifically induced in pathological or related situations have been intensively studied from a biotechnological perspective. Pathogenesis related proteins can act as a constitutive defense tool against microbial pathogens and invertebrate pests. Structural and Functional Analysis of seed or bulb proteins have exploited their scope towards industrial and pharmaceutical applications. In this context, a pharmaceutically important ribosome-inhibiting Lectin protein and biotechnological important pesticide chitinase were thoroughly studied. The X-ray structure of a tetrameric lectin (CVL) from the spring Crocus plant (Crocus vernus) was determined and refined to an final R-factor of 17.3% and Rfree of 22.5%, respectively. The protein was crystallized by the hanging drop method using 4 M Sodium formate as a precipitant. Crystals diffracted to 1.94 Å resolution having unit-cell parameters of a = 48.2 b = 98.0 and c = 105.9 Å and the space group P21212. There were two dimers in the asymmetric unit. The overall folding of the lectin is similar to that observed for snowdrop lectin. The tetramer is composed of two homo dimers with chains A and B as one dimer formed by chains C and D. Stable dimers have been particular formed by monomers through the exchange of C-terminal strands interactions. The two chains of one dimer share a primary amino acid sequence homology of approx. 38 %. The protein is rich in Val, Asn, Gly and Leu and contains eight Cys residues. A single intra-chain disulfide bridge has been found in each of the individual chains of the tetramer. A total of 339 bound water molecules, three glycerol molecules and eight formate (HCOO-) molecules, which could be located in the refined 2 Fo-Fc electron density map, were included in the final model. The amino acid sequence showed marginal sequence homology of approx. around 40% with already deposited mannose specific lectin structures in the protein data bank. The coordinate information for CVL has already been deposited in the protein data bank (PDB) with code 3mez. A superposition of with those mannose specific lectins with CVL showed particular highly conserved structural motifs of anti-parallel ß-sheets. The structure of CVL has been solved by Multiple Isomorphous Replacement (MIR), using Platinum and Mercury metal derivatives.
Further, the C. vernus chitinase (CVC) was purified and crystallized. Crystals belonged to monoclinic, space group C2, with unit cell parameters a = 171.81, b = 36.55, c = 125.28 Å and ß = 126.9°. The crystals diffracted to 2.1 Å resolution applying synchrotron radiation and the X-ray structure was refined to initial R-factor of 30% and Rfree of 37%, respectively.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Struktur-Funktions-Beziehungen ausgewählter pflanzlicher Abwehrproteine die unter pathologischen oder pathologisch verwandten Bedingungen induziert und aktiviert werden, wurden im Rahmen der hier zusammengefassten Promotionsarbeit im Hinblick auf biotechnologische und pharmazeutische Anwendungen untersucht. Die ausgewählten Proteine werden von Pflanzen als konstitutives Verteidigungsmittel gegen mikrobielle Krankheitserreger und wirbellose Schädlinge eingesetzt.. In diesem Kontext wurde ein pharmazeutisch bedeutsames ribosominhibierendes Lektin sowie ein biotecnologisch bedeutschames, als Pestizid wirkendes Enyzm aus der Familie der Chitinasen besonders intensiv analysiert. Die Röntgenstruktur des tetrameren Lektins (CVL) aus dem Frühlingscrocus (Crocus vernus) wurde aufgeklärt und zu einem finalen R-Faktor von 17,3% und einem Rfree-Wert von 22,5% verfeinert. Vorausgehend wurde das Protein mittels der "hanging drop" Methode kristallisiert, wobei 4 M Natriumformiat als Präzipitant diente. Die Kristalle diffraktierten zu einer Auflösung von 1,94 A. Die Raumgruppe der Kristalle ergab sich zu P212121 und Zellparametern von a = 48.2 b = 98.0 and c = 105.9 Å mit jeweils zwei Dimeren in der asymmetrischen Einheit. Die Faltung dieses Lektins ist derjenigen des sogenannten Schneetropfen-Lektins ähnlich. Ein Tetramer setzt sich aus jeweils zwei Homodimeren mit den Ketten A und B und den Ketten C und D zusammen. Die Dimere werden insbesondere über Wechselwirkungen zwischen den C-terminalen Strängen stabilisiert. Die beiden Ketten eines Dimers teilen eine primäre Aminosäuresequenzhomologie von ca. 38%. Das Protein ist reich an Val, Asn, Gly und Leu und enthält acht Cys-Reste. Eine intramolekulare Disulfidbrücke findet sich in jeder Kette eines Tetramers. Zusätzlich wurden 339 gebundene Wassermoleküle, drei Glycerinmoleküle und acht Formiationen in der verfeinerten 2 Fo-Fc Elektronendichtekarte gefunden und in das endgültige Modell aufgenommen. Die Aminosäuresequenz des CVL zeigt eine geringe Sequenzhomologie von ca. 40% mit bereits in der Protein Data Bank hinterlegten Strukturen von Mannose-spezifischem Lektin. Die Koordinierung von Informationen für CVL bereits hinterlegt in der Protein Data Bank (PDB) mit Code 3mez. Allerdings zeigte und bestätigte die Überlagerung mit diesen Mannose-spezifischen Lektinen hochkonservierte Strukturmotive von antiparallelen ß-Faltblättern. Die Struktur des CVL konnte durch Anwendung der Methode des multiisomorphen Ersatzes (Multiple Isomorphous Replacement, MIR) mit Platin-und Quecksilber-Derivaten gelöst worden.
Weiterhin wurde eine Chitinase (CVC) aus Crocus vernus isoliert, aufgereinigt und kristallisiert. Die Kristalle zeigten Diffraktion bis 2,1 Å und gehörten zur monoklinen Raumgruppe C2 mit den Zellkonstanten a = 171.81, b = 36.55, c = 125.28 Å und ß= 126,9 ° . Die initiale Verfeinerung der Struktur resultierte zu einem R-faktor von 30% und Rfree von 37%.


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