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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-51178
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5117/


The ternary gyrase-DNA-quinolone complex: from molecular modelling to understanding quinolone action and resistance

Der ternäre Gyrase-DNA-Chinolon Komplex: Von der molekularen Modellierung zum Verständnis der Chinolon-Wirkung und der Chinolon-Resistenz

Lenz, Jörn-Benjamin

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SWD-Schlagwörter: Molekulardesign , Gyrasehemmer , Resistenz , QSAR , Molekulardynamik , Docking , Docking protein , DNS-Gyrase
Freie Schlagwörter (Deutsch): Konservierungs-Analyse
Freie Schlagwörter (Englisch): quinolones, resistance, modelling, CoMSIA, gyrase
Basisklassifikation: 44.40
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.02.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 02.05.2011
Kurzfassung auf Englisch: Fluoroquinolones are losing their effectiveness due to emerging bacterial resistance. One known reason for this is the alteration of the drugs’ molecular target, the DNA-gyrase in complex with DNA. But due to the lack of crystal structures of the complete gyrase-holoenzyme, this work aimed to build a 3D complex by using molecular modelling techniques. A protein-DNA-docking method was initially used to search for plausible complexes of the crystal structure of a 59 kDa fragment of the E. coli GyrA N-terminal domain (GyrA59) and a 21 bp dsDNA. In order for the ester bond to form, the DNA must approach the protein in roughly the right configuration. Therefore, starting from the docking step, molecular dynamics (MD) simulations of the plausible non-covalent protein-DNA complexes were carried out. Promising complexes were picked after manual assessment and subjected to further simulations with the covalent bond in place. Finally, two covalently linked protein-DNA complexes that differed by their DNA binding modes were picked: The GyrA59 alpha4-helix of complex 20 pointed towards the major groove of the DNA while it was oriented towards the minor groove in complex 166. Both complexes provided evidence for a possible role of Arg91 for the binding of DNA and the formation of a potential quinolone binding pocket. Although complex 20 could better reconcile existing biochemical data, both complexes were used as target structures for the molecular docking of eleven quinolones. All dockings showed ring stacking interactions but significantly differed with respect to the drugs’ orientations and the resulting interactions with DNA and the alpha4-helix. Dockings into complex 20 yielded three sets with different drug poses. The placement of quinolones within complex 166 were much more heterogenous and yielded twelve subsets with different drug orientations. Although some poses were able to explain the influence of known resistance mutations on drug binding, none was able to explain all resistance mutations and the important role of Mg2+. A recently released crystal structure of S. pneumoniae topoIV in complex with DNA and quinolone was used to evaluate the theoretical models. The orientation of the drugs in the theoretical models could not exactly reproduce the crystal structure, but the results for complex 20 were very close to the experimental data. This showed the applied method to be a very reasonable protocol. Crystal structures were also taken to derive a CoMSIA model based on cleavage activities. This was subsequently examined on the basis of a homology model built for the E. coli gyrase-DNA-quinolone complex. It could be used to explain quinolone effects on steric and electrostatic grounds: Substituents at the quinolones’ C7 are favorable if they reach a volume that, in the light of ciprofloxacin, is located around the N4 of the 7-piperazinyl moiety. Moreover, the models indicate that a positive electrostatic potential enhances the drugs’ activity if it is placed in the same region. This allows interactions with negative electrostatic potentials of GyrB residues Gln465 and Glu466. By contrast, substituents that protrude from this volume lead to steric clash with the same GyrB residues and decrease quinolone activity. Additionally, electron-withdrawing substituents like C6-fluoro or C8-methoxy were found to be beneficial. They decrease the electron-density of the quinolones’ ring system and thus increase ring stacking interaction between the therapeutics and the adjacent DNA bases. Together with the CoMSIA, the results of a conservation analysis of gyrase residues could partly reconcile mutation data and MIC measurements that were generously provided by A. and P. Heisig. Thus, the significant increase of MICs for different quinolones resulting from a GyrA Ser83Asn mutation could be explained. Such exchange pushes the drugs into the disfavored steric region. This induces steric clashes with GyrB Gln465 and Glu466 of which the former one was found to be variable while the latter one appeared to be conserved. Interestingly, Gln465 is most often exchanged to Glu and Asp. Such mutations may strengthen the interaction with amphoteric drugs and increase the susceptibility of gyrase. Nevertheless, some mutations could not be explained by simple protein-drug interactions. From the analyses however one could suggest that Gln465 and Glu466 of GyrB and the conserved GyrA Arg121 which is also close to the bound quinolone, might be useful residues to target with drugs.
Kurzfassung auf Deutsch: Aufgrund zunehmender Resistenzen verlieren Fluorchinolone an Wirksamkeit. Ein Grund dafür sind Mutationen, die zur Veränderung ihrer molekularen Zielstruktur, dem Komplex aus DNA und Gyrase, führen. Aufgrund fehlender Strukturen des vollständigen Holoenzyms, wurde in dieser Arbeit ein 3D-Strukturmodell des Gyrase-DNA-Chinolon Komplexes mit Hilfe von Molecular Modelling Techniken erstellt. Zunächst wurde ein Protein-DNA Docking Verfahren verwendet, um ausgehend von der 59 kDa Partialstruktur der N-terminalen GyrA Domäne (GyrA59) von E. coli und einer 21 bp dsDNA, Protein-DNA Komplexe zu erzeugen. Ausgehend von der Annahme, dass sich die DNA dem Protein in einer geeigneten Weise nähern muss, damit es zur Ausbildung der kovalenten Protein-DNA Verknüpfung kommt, wurden nachfolgend Moleküldynamik (MD) Simulationen der plausibelsten nicht-kovalent gebundenen Protein-DNA Komplexe durchgeführt. Die aussichtsreichsten Kanditen wurden manuell ausgewählt und für weitere MD Simulationen von kovalent verbundenen Komplexen aus GyrA59 und DNA verwendet. Die zwei resultierenden GyrA59-DNA Komplexe unterschieden sich hinsichtlich ihrer DNA Bindungsmodi: Während die GyrA59 alpha4-Helix des Komplexes 20 in die große Furche der DNA ragte, zeigte diese Helix in Komplex 166 in die kleine Furche. Beide Komplexe lieferten Hinweise auf eine mögliche Rolle von GyrA Arg91 für die Bindung der DNA und die Ausbildung einer potentiellen Chinolon-Bindetasche. Existierende biochemische Daten ließen sich zwar besser mit Komplex 20 in Einklang bringen. Dennoch wurden beide Komplexe als Zielstrukturen für das Docking von elf Chinolonen verwendet. Alle Ergebnisse zeigten zwar Ring-Stacking Wechselwirkungen mit DNA Basen, unterschieden sich jedoch signifikant hinsichtlich der Chinolon-Orientierungen und der daraus resultierenden Wechselwirkungen mit DNA und Protein. Ein Docking in Komplex 20 lieferte drei verschiedene Posen, während 12 für Komplex 166 gefunden wurden. Obwohl manche Posen eine Erklärung für den Einfluss bekannter Resistenzmutationen ermöglichen, war keine Orientierung in der Lage, alle Resistenzmutationen sowie die wichtige Rolle von Mg2+ zu erklären. Der Vergleich der theroretischen Modelle mit einer kürzlich publizierten Struktur eines TopoIV-DNA-Chinolon Komplexes aus S. pneumoniae zeigte zwar, dass die Orientierung der Chinolone in den Kristallstrukturen nicht exakt reproduziert werden konnte. Dennoch lag das Modell für Komplex 20 sehr nah an den experimentellen Strukturen, wodurch gezeigt werden konnte, dass der hier gewählte Ansatz eine geeignete Methode zur Modellierung von Proteinstrukturen darstellt. Die Kristallstrukturen wurden auch für die Erstellung eines auf Cleavage-Daten basierenden CoMSIA Modells verwendet. Dieses wurde anschließend auf der Basis eines Homologiemodells des E. coli Gyrase-DNA-Chinolon Komplexes analysiert und konnte die Chinolon-Aktivität aus sterischer und elektrostatischer Sicht erläutern: Substituenten an C7 zeigen einen positiven Effekt auf die Aktivität wenn sie in ein Volumen ragen, welches bezogen auf Ciprofloxacin, um das N4 der 7-Piperazinyl Gruppe lokalisiert ist. Ein positives elektrostatisches Potential in diesem Bereich verstärkt die Aktivität. Hierdurch werden Interaktionen mit negativen elektrostatischen Potentialen der GyrB Positionen Gln465 and Glu466 ermöglicht. Ragen C7-Reste über dieses Volumen hinaus, kommt es zu sterischen Problemen mit diesen GyrB Positionen. Zusätzlich bewirken elektronenziehende Reste wie C6-Fluor oder C8-Methoxy eine Verringerung der Elektronendichte im Chinolon-Ringsystem und verstärken dadurch das Stacking mit benachbarten DNA Basen. Zusammen mit dem CoMSIA-Modell konnte die Analyse der Konservierung von Gyrase teilweise mit Daten aus Selektions- und MHK-Versuchen von A. and P. Heisig in Einklang gebracht werden. So war zum Beispiel der deutliche MHK Anstieg verschiedener Chinolone das Ergebnis einer GyrA Ser83Asn Mutation. Diese drückt die Arzneistoffe in die sterisch ungünstige Region und induziert Konflikte mit der variablen GyrB Gln465 und der konservierten Glu466 Position. Gln465 ist dabei meistens durch Glu oder Asp ersetzt. Solche Austausche könnten die Interaktion mit amphoteren Chinolonen verstärken und deren Wirksamkeit erhöhen. Jedoch konnten nicht alle Mutationen durch Protein-Ligand Wechselwirkungen erklärt werden. Die Analysen zeigen jedoch, dass Gln465 und Glu466 in GyrB sowie das sich in Chinolon-Nähe befindliche und konservierte GyrA Arg121, interessante Positionen für den Angriff durch neue Arzneistoffen darstellen könnten.

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