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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-51589
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5158/


Charakterisierung von RNA-Aptameren mit Spezifität für den humanen Interleukin-6-Rezeptor

Characterization of RNA-aptamers specific for the human interleukin-6-receptor

Eydeler, Katja

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SWD-Schlagwörter: Aptamer , Interleukin 6 , Charakterisierung , RNS
Freie Schlagwörter (Deutsch): Interleukin-6-Rezeptor , Internalisierung
Freie Schlagwörter (Englisch): aptamer , interleukin-6-receptor , internalization
Basisklassifikation: 58.30 B
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 27.05.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Zytokine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation zahlreicher Zellfunktionen. Ihre Bindung an spezifische Rezeptorkomplexe löst intrazelluläre Signaltransduktionswege aus, die das Wachstum und die Differenzierung ihrer Zielzellen beeinflussen. So nimmt Interleukin-6 (IL-6) eine Schlüsselstellung bei der Wechselwirkung des angeborenen und des
erworbenen Immunsystems ein. Seine Funktion als Botenstoff übt IL-6 durch die Bindung an einen IL-6-Rezeptorkomplex aus. Dieser besteht aus dem eigentlichen IL-6-Rezeptor (IL-6R) und zwei Einheiten des Glykoproteins gp130 [3]. Der Rezeptorkomplex unterliegt ständigen Recycling-Prozessen, wobei die Endozytose durch die Bindung von IL-6 beschleunigt wird.
Mittels eines in vitro Evolutionsprozesses konnten RNA-Aptamere mit Spezifität für den löslichen IL-6R isoliert und auf das minimale Bindemotiv reduziert werden. Somit konnte das hochspezifische Aptamer 16-3A (19 nt) generiert werden, welches das tertiäre Strukturmotiv eines G-Quadruplexes annimmt.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Charakterisierung des Aptamers 16-3A im Hinblick auf die für die Bindung essentiellen Basen und die Möglichkeit, das Aptamer als Vehikel für den Zell-spezifischen Transport zu nutzen.
Über Filterbindungsstudien und Messung der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) konnte eine Dissoziationskonstante von 67 nM (Filterbindungsstudie) bzw. 9 nM (SPR) für das Aptamer 16-3A ermittelt werden. Anhand von Mutationsanalysen wurde der Einfluss einzelner Basen auf die Bindung zwischen dem Aptamer 16-3A und dem IL-6R untersucht. Dabei erwiesen sich fünf der elf analysierten Basen als essentiell. Das Einführen eines
2‘-F-Cytosins führte hingegen nicht zum Verlust der Affinität, konnte die Stabilität des Aptamers in Serum-enthaltenem Medium aber nur geringfügig steigern. Mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte nicht nur die Bindung des Aptamers 16-3A an den membranständigen IL-6R, sondern auch die Rezeptorvermittelte
spezifische Internalisierung des Aptamers nachgewiesen werden. Dabei wurde gezeigt, dass die intrazelluläre Aufnahme des Aptamers nicht von IL-6 abhängig ist und weder einen pro- noch anti-proliferierenden Effekt auf IL-6R-tragende Zellen ausübt.
Eine kovalente Verknüpfung des Aptamers mit siRNAs führte zu keiner Beeinträchtigung der Affinität zwischen dem Aptamer und dem IL-6R, wie anhand von Filterbindungsstudien und Durchflusszytometrie gezeigt wurde. Des Weiteren konnten diese Chimären in in vitro Studien durch rekombinanten Dicer prozessiert werden. Der Nachweis einer Herabregulierung der Zielgene der Chimären, murines STAT3 und murines STAT5 nach Transfektion bzw. nach erfolgter Rezeptor-spezifischer Aufnahme, war hingegen mittels einer Western-Blot-Analyse nicht möglich.
Erhöhte IL-6 Konzentrationen bzw. eine Dysregulation der löslichen Formen des Rezeptorkomplexes spielen bei verschiedenen Erkrankungen eine Rolle. Eine mögliche therapeutische Anwendung bietet die Inhibierung des IL-6 vermittelten Signalweges. In folgenden Studien bleibt zu klären, ob die Stabilität des Aptamers 16-3A gegen über Ribonukleasen durch weitere postselektive Modifikationen gesteigert werden kann. Dies würde eine systemische Anwendung des Aptamers in Konjugation mit Liganden wie Toxinen oder therapeutisch wirksamen siRNAs ermöglichen. Auch eine markierende Wirkung des Aptamers für die in vivo Detektion des löslichen oder membranständigen IL-6-Rezeptors könnte so erreicht werden.
Kurzfassung auf Englisch: Cytokines play an important role in the regulation of numerous cellular functions. Their binding to specific receptor complexes triggers signal transduction pathways which affect the growth and differentiation of their target cells. Interleukin-6 (IL-6) enters a key switch position in the interaction of the innate and adaptive immune system. The cytokine
exerts its function after binding to an IL-6 receptor complex. This consists of the IL-6 receptor (IL-6R) and two units of the glycoprotein gp130. The receptor complex is subject to constant recycling processes, where the endocytosis is accelerated by the binding of IL-6. The application of an in vitro evolutionary process enabled the isolation of RNA-aptamers with specificity for the soluble IL-6R. The Aptamers were shortened to the minimal binding motif and the G-rich Aptamer 16-3A was identified. This 19 nt long variant adopts the
structure motif of a guanine quadruplex.
The present work describes the characterization of the aptamer 16-3A with respect to the bases essential for binding between the Aptamer and the target protein. Further the possible use of the aptamer as a vehicle for the cell-specific transport of siRNAs was investigated. It turned out that five of the eleven bases analyzed were as essential for affinity as measured
by filter binding assays and surface plasmon resonance (SPR). A dissociation constant of 9 nM for SPR-measurements and of 67 nM for filter binding studies was obtained for the RNA-Aptamer 16-3A. The introduction of a 2'-F cytosine at position 8 however did not lead to the loss of affinity but could increase the stability of the aptamer in serum-containing medium only slightly. By flow cytometry and confocal fluorescence microscopy the binding of the aptamer 16-3A to the membrane-bound IL-6R was determined. Furthermore the specific receptor-mediated internalization of the aptamer could be detected. It was shown that the cellular uptake of the aptamer was not dependent on IL-6, and neither pro- nor anti-proliferative effects on
IL-6R bearing cells occurred after aptamer-binding or -internalization
Covalent linkage of the aptamer with siRNAs did not affect the affinity between the aptamer and the IL-6R, as it was shown by filter binding studies and flow cytometry. Additionally, these chimeras were processed by recombinant human Dicer as shown by in vitro studies. A down-regulation of target genes of the chimeras, murine STAT3 and murine STAT5 after transfection or after receptor-specific uptake was, however, not be detected by Western-Blot analysis. Increased IL-6 concentrations and a dysregulation of the soluble forms of the receptor complex play a role in various diseases. A possible therapeutic application is the inhibition of the IL-6 mediated signaling pathway. In prospective studies it remains to be determined
whether the stability of the aptamer 16-3A against ribonucleases can be increased by further post-selective modifications without loss of affinity. This would approve a systemic application of the aptamer in conjugation with ligands such as toxins or therapeutically effective siRNAs. Also, a marking effect of the aptamer for the in vivo detection of soluble or membrane-bound IL-6 receptor could be helpful.

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