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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-51693
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5169/


Untersuchungen zum Metabolismus des Ca2+-freisetzenden Botenstoffs NAADP

Schmid, Frederike

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Freie Schlagwörter (Deutsch): NAADP, T-Lymphozyten, HeLa-Zellen, Alkalische Phosphatase, CD38
Basisklassifikation: 35.70 , 42.13 , 42.15 , 44.48 , 44.45 , 35.74
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Guse, Andreas H. (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 15.06.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Ca2+ ist ein wichtiger intrazellulärer Botenstoff, der viele unterschiedliche Zellfunktionen wie beispielsweise Exozytose, Muskelkontraktion und Transkription kontrolliert. Um eine solche Vielfalt zu ermöglichen, wird die intrazelluläre Ca2+-Konzentration zeitlich und räumlich präzise reguliert. Gewährleistet wird dies durch das komplexe Zusammenspiel der Ca2+-freisetzenden Botenstoffe D-myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3), cyclische ADP-Ribose (cADPR), und Nikotinsäureadenindinukleotid-2’-phosphat (NAADP) sowie Ca2+-Pumpen und Ca2+-Speichern.
Eine besondere Rolle kommt dabei dem Botenstoff NAADP zu, der als Schrittmacher der Ca2+-Signalgebung dient. Zudem ist NAADP der wirksamste Ca2+-freisetzende Botenstoff und löst schon in nanomolaren Konzentrationen ein Ca2+-Signal aus. Mikromolare Konzentrationen NAADP dagegen können den NAADP-Signalweg inaktivieren und damit die Ca2+-Signalgebung unterbrechen. Daher ist eine präzise Regulation der intrazellulären NAADP-Konzentration Voraussetzung für eine funktionelle Signalübertragung. Die Fragen zum Metabolismus von NAADP sind allerdings noch weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden NAADP-abbauende Aktivitäten in Jurkat-T-Lymphozyten und HeLa-Zellen untersucht.
Lange Zeit hielt man das Ektoenzym CD38 für die Synthese von NAADP verantwortlich. Experimente an CD38-knock down-Zelllinien und CD38-knock out-Mäusen deuten jedoch daraufhin, dass CD38 am Abbau von NAADP beteiligt sein könnte. Für die Untersuchungen an Jurkat-T-Lymphozyten wurden CD38-exprimierende Wildtyp-Zellen sowie CD38-knock down-Zellen verwendet. Zunächst wurde die verminderte Expression von CD38 in den knock down-Zellen bestätigt und die Enzymaktivität von CD38 mit Hilfe von fluoreszierenden Substraten analysiert. Im Anschluss wurden HPLC-Analysen durchgeführt, die zeigten, dass CD38 im sauren Milieu NAADP bilden kann. Im neutralen Milieu hingegen wird NAADP durch CD38 zu 2-Phospho-ADP-Ribose und Nikotinsäure abgebaut. Die katalytischen Eigenschaften konnten an rekombinant in HEK-293-Zellen exprimiertem CD38 bestätigt werden.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem NAADP-Abbau in HeLa-Zellen. HeLa-Zellen exprimieren das Enzym CD38 nicht. Dennoch konnte in diesem Zellsystem eine NAADP-abbauende Aktivität nachgewiesen werden. In HeLa-Zellen muss demnach ein anderes Enzym für den NAADP-Abbau verantwortlich sein. Zunächst konnte gezeigt werden, dass NAADP zu NAAD dephosphoryliert wird. Im Anschluss wurde die neue NAADP-abbauende Aktivität enzymkinetisch mittels colorimetrischer Enzymaktivitätsassays sowie HPLC-Analytik untersucht. Im Zuge dieser Experimente wurde zum ersten Mal eine HPLC-Methode entwickelt, welche die Analytik von 200 fmol – 1 pmol NAADP bzw. NAAD erlaubte. Die Bestimmung des pH-Optimums der Abbau-Reaktion sowie Inhibitionsversuche legten nahe, dass es sich bei der untersuchten Aktivität um eine alkalische Phosphatase handelte. Die Expression alkalischer Phosphatasen in HeLa-Zellen konnte durch RT-PCR und Western Blot nachgewiesen werden. Die rekombinante Expression der alkalischen Phosphatase in HEK-293-Zellen bestätigte, dass NAADP durch das Enzym umgesetzt wird und damit ein neues Substrat für die alkalische Phosphatase darstellt.
Untersuchungen zur Struktur-Wirkbeziehung der Ca2+-Freisetzung durch NAADP im Seeigelei zeigten drei mögliche Abbauwege für NAADP: 1. Die Entfernung der Nikotinsäure-Gruppe, 2. die Dephosphorylierung an 2’-Position der Ribose sowie 3. die Deamidierung des Adenins. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass in verschiedenen Zellsystemen unterschiedliche Enzyme am Abbau von NAADP beteiligt sind. Während in Jurkat-T-Lymphozyten durch CD38 die Nikotinsäure-Gruppe von NAADP entfernt wird, wird in HeLa-Zellen NAADP durch die alkalische Phosphatase dephosphoryliert. Die beiden Zellsysteme haben demnach unterschiedliche Strategien entwickelt, um den Ca2+-freisetzenden Botenstoff NAADP abzubauen. Zusätzlich nehmen die multifunktionellen Enzyme CD38 und alkalische Phosphatase Einfluss auf weitere Signalwege. Möglicherweise entstanden je nach Zelltyp andere Strategien zur Verknüpfung verschiedener Signalwege.
Kurzfassung auf Englisch: Ca2+ is a universal second messenger regulating a wide variety of cell functions such as exocytosis, muscle contraction and gene transcription. The concerted interplay of the Ca2+-releasing second messengers D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), cyclic ADP ribose (cADPR) and nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) as well as Ca2+ pumps and Ca2+ stores encodes specific messages by varying calcium signals in space, amplitude and time. Thus, the cell exploits the variability of Ca2+ signals to control a multitude of pathways.
NAADP plays a pivotal role as a trigger for the development of global Ca2+ signals. Furthermore, NAADP is the most potent Ca2+-releasing second messenger known to date: It induces Ca2+ signals at concentrations in the low nanomolar range. At the same time, micromolar concentrations of NAADP can desensitize the NAADP signaling pathway and thus interrupt the Ca2+ signal. Therefore, precise control of the intracellular NAADP concentration is essential for functional Ca2+ signaling. However, the molecular mechanisms of NAADP metabolism remain to be elucidated. In the present study, NAADP metabolizing activities in Jurkat T lymphocytes and HeLa cells were investigated.
For a long time, the enzyme CD38 was considered responsible for the synthesis of NAADP. Recent insights from CD38 deficient cells and CD38 knock out mice, however, indicated that CD38 might instead be involved in NAADP degradation. To shed light on this issue, this study compared wild type Jurkat T lymphocytes expressing CD38 to CD38 knock down cells. First, reduced expression of CD38 in CD38 knock down cells was verified by analyzing enzyme activity utilizing fluorescent substrates. Then, NAADP formation by CD38 at acidic pH was analyzed by HPLC. At neutral pH however, NAADP was metabolized to ADP-ribose 2’-phosphate and nicotinic acid by CD38. The catalytic properties of CD38 were confirmed by experiments with CD38 recombinantly expressed in HEK-293 cells.
The second part of this study focused on NAADP metabolism in HeLa cells. HeLa cells do not express CD38 but possess NAADP degrading activity. This indicates that HeLa cells feature a different enzyme responsible for the metabolism of NAADP. Initially, NAADP was shown to be degraded to NAAD, which implies that the NAADP degrading activity is executed by a phosphatase. The newly discovered activity was characterized by colorimetric enzyme assays and HPLC. To make this possible, a new HPLC method was developed which allowed for the first time the detection of very small amounts of NAADP and NAAD (200 fmol – 1 pmol). The determination of the pH optimum and inhibitor studies suggested that the newly discovered activity was an alkaline phosphatase. The expression of alkaline phosphatase in HeLa cells was demonstrated by RT-PCR and Western blot. Subsequent recombinant expression of this alkaline phosphatase in HEK-293 cells confirmed that NAADP is degraded by the enzyme and therefore might function as a new substrate for alkaline phosphatase.
Analysis of the structural determinants of the Ca2+-releasing NAADP function revealed three possible pathways for the degradation of NAADP: 1st removal of the nicotinic acid group, 2nd dephosphorylation of the 2’ position of the ribose and 3rd deamidation of the adenine. The results of the present study indicate that different cell types use different pathways for the degradation of NAADP. While in Jurkat T lymphocytes CD38 removes the nicotinic acid group of NAADP, in HeLa cells alkaline phosphatase dephosporylates NAADP. Thus, these cell types developed a different strategy to metabolize the Ca2+ releasing second messenger NAADP. This might be important for cross talk between different signaling pathways as the multifunctional enzymes CD38 and alkaline phosphatase also act on other signaling pathways.

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