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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-52119
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5211/


Analyse der Funktion des humanen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktors alphaPIX bei der Regulation des EGF-Rezeptor-Traffickings

Analysis of the function of human guanine nucleotide exchange factor alphaPIX in regulation of EGF receptor trafficking

Kortüm, Fanny

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SWD-Schlagwörter: Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , Guaninnucleotid-Austauschfaktoren , Endocytose
Freie Schlagwörter (Deutsch): Protein Trafficking, Ubiquitylierung , Protein-Protein-Interaktion
Freie Schlagwörter (Englisch): endocytosis , recycling , trafficking , egf receptor
Basisklassifikation: 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kutsche, Kerstin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.01.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 25.08.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Mutationen im ARHGEF6-Gen verursachen eine Form der X-chromosomal vererbten, unspezifischen geistigen Behinderung (XLMR) beim Menschen. Bei der XLMR handelt es sich um eine sehr heterogene Erkrankung, für die bis heute mehr als 80 Krankheitsgene identifiziert wurden. Dementsprechend mannigfaltig sind auch die Funktionen der von diesen Genen kodierten Proteine. Einige davon sind in die Regulation des vesikulären Transports (Vesikel-Trafficking) involviert. Vesikel-Trafficking dient mittels membranumschlossener Vesikel dem Transport von Proteinen zwischen unterschiedlichen Zellorganellen sowie zwischen Zellen und ihrer Umgebung. Auch Rezeptor-Tyrosinkinasen, wie etwa der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-Rezeptor), unterliegen einem kontrollierten intrazellulären Transport: Wachstumsfaktor-Bindung initiiert eine Vesikel-abhängige Internalisierung (Endozytose) des EGF-Rezeptors, worauf dieser entweder wieder an die Zelloberfläche zurücktransportiert (Recycling) oder in Lysosomen abgebaut (Degradierung) wird. Dieses Trafficking bestimmt maßgeblich die Weiterleitung von Signalen ausgehend von aktivierten EGF-Rezeptoren, so dass EGF-Rezeptor-Signaltransduktion und -Trafficking eng miteinander verknüpft sind.
Das XLMR-Gen ARHGEF6 kodiert für den Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) alphaPIX, ein Protein, das als Modulator der Aktivität von Rho-GTPasen gilt, indem es den Austausch von GDP nach GTP katalysiert.
Mittels Protein-Protein-Interaktionsstudien wurde eine direkte Interaktion von alphaPIX mit der Ubiquitin-E3-Ligase c-Cbl nachgewiesen. c-Cbl verknüpft das Markerprotein Ubiquitin kovalent an EGF-Rezeptoren und markiert diese somit für den lysosomalen Proteinabbau. Tryptophan 197 in der SH3-Domäne von alphaPIX und Arginin 829 im PKPFPR-Motiv von c-Cbl wurden als essentielle Aminosäuren für die alphaPIX::c-Cbl-Interaktion identifiziert. Immunfluoreszenzanalysen an H4-Neurogliazellen ergaben, dass endogenes alphaPIX nach EGF-Stimulation an die Plasmamembran rekrutiert wird und dort mit c-Cbl und dem EGF-Rezeptor kolokalisiert. Dieser Hinweis auf eine EGF-abhängige Regulation der Assoziation zwischen alphaPIX und c-Cbl konnte mittels Ko-Immunpräzipitationen erhärtet werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es nach EGF-Stimulation zu einer Abnahme der absoluten alphaPIX- und c-Cbl-Proteinmengen kommt und diese Reduktion von der alphaPIX::c-Cbl-Interaktion und der Ubiquitin-Ligase-Aktivität von c-Cbl abhängig ist. Gut vereinbar mit dieser Beobachtung ergaben Ubiquitylierungsassays, dass sowohl alphaPIX als auch c-Cbl ubiquityliert werden. Aufgrund dieser Daten wird vermutet, dass alphaPIX im Rahmen des EGF-Rezeptor-Traffickings c-Cbl temporär sequestriert und somit die Ubiquitin-E3-Ligase daran hindert, den EGF-Rezeptor für die Degradierung zu markieren. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bereits für das alphaPIX-homologe Protein alphaPIX vorgeschlagen.
Um die Auswirkungen von alphaPIX auf das EGF-Rezeptor-Trafficking im Detail zu untersuchen, wurden mit Hilfe des Flp-In-Systems Zelllinien generiert, die alphaPIX-Wildtyp bzw. mutierte alphaPIX-Varianten stabil exprimieren. In alphaPIX-überexprimierenden Zellen konnte mittels Zelloberflächen-Biotinylierungsexperimenten eine um ~65% verminderte EGF-Rezeptor-Degradierung festgestellt werden, die durch die bereits erwähnte alphaPIX-vermittelte c-Cbl-Seques¬trierung erklärt werden könnte. Bemerkenswerterweise wurde jedoch noch ein zweiter, c-Cbl-unabhängiger alphaPIX-Einfluss auf das EGF-Rezeptor-Trafficking aufgedeckt: alphaPIX steigert nach EGF-Stimulation das Recycling von internalisierten EGF-Rezeptoren zurück an die Zelloberfläche um das 4-fache, wobei die GEF-Aktivität von alphaPIX für diesen Effekt entscheidend zu sein scheint. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Hypothese aufgestellt, dass alphaPIX das Recycling des EGF-Rezeptors verstärkt, indem es als GEF die Rho-GTPasen Rac1 und Cdc42 aktiviert und so zeitlich und örtlich die Reorganisation des Aktinzytoskeletts reguliert. Diese Annahme steht im Einklang mit bereits beschriebenen Funktionen des Aktinzytoskeletts während des vesikulären Transports.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse legen für alphaPIX eine Rolle als bidirektionaler Schalter während des EGF-Rezeptor-Traffickings nahe: Auf der einen Seite beschleunigt alphaPIX das EGF-Rezeptor-Recycling, auf der anderen Seite hemmt alphaPIX den EGF-Rezeptor-Abbau. Diese neuen molekularen Funktionen von alphaPIX unterstreichen die Bedeutung von intrazellulären Transportmechanismen für eine normale Entwicklung der kognitiven Fähigkeiten beim Menschen.
Kurzfassung auf Englisch: X-linked non-specific mental retardation (XLMR) is a very heterogeneous disorder. Mutations in >80 genes encoding proteins with a variety of functions have yet been identified. Some of these proteins are implicated in the regulation of vesicular trafficking suggesting a critical role of intracellular transport mechanisms for the development of human cognitive abilities. The XLMR gene ARHGEF6 encodes the guanine nucleotide exchange factor alphaPIX which modulates the activity of Rho GTPases by catalyzing the exchange of GDP for GTP within particular spatio-temporal contexts. We report here for the first time that alphaPIX is a potent dual-function regulator of epidermal growth factor (EGF) receptor trafficking.
By protein-protein interaction studies using neuronal and non-neuronal cells we could demonstrate direct binding of alphaPIX to the E3 ubiquitin ligase c-Cbl, an enzyme that attaches ubiquitin to EGF receptors, thereby labelling them for degradation. This interaction is mediated by tryptophan 197 in the SH3 domain of alphaPIX and arginine 829 in the PKPFPR-motif of c-Cbl. EGF stimulation of H4 neuroglioma cells resulted in translocation of alphaPIX to the plasma membrane where it co-localized with c-Cbl and the EGF receptor. Indeed, alphaPIX::c-Cbl complex formation was found to be stimulated by EGF. In addition, alphaPIX and c-Cbl protein levels decrease upon EGF stimulation and this downregulation is dependent on both alphaPIX::c-Cbl complex formation and c-Cbl ubiquitin ligase activity. In line with this, our results from ubiquitylation assays indicate that alphaPIX and c-Cbl are ubiquitylated suggesting degradation of both proteins by the proteasome system. Based on our data, we hypothesize that alphaPIX is required for temporal sequestration of c-Cbl during EGF receptor trafficking, thereby preventing ubiquitylation and subsequent degradation of EGF receptors. A similar mechanism has been proposed for betaPIX, the close homologue of alphaPIX. By applying cell surface biotinylation assays we could indeed demonstrate decreased lysosomal EGF receptor degradation in cells ectopically expressing alphaPIX. Remarkably, we uncovered a second, c-Cbl-independent alphaPIX mode of action during EGF receptor trafficking: By surface biotinylation assays we demonstrated that alphaPIX strongly enhances recycling of internalized EGF receptors back to the cell surface upon EGF stimulation, and its GEF activity is crucial for this effect. Our immunofluorescence analysis confirmed that EGF is enriched in recycling vesicles and gradually disappeared from the cytoplasm in alphaPIX overexpressing cells. Quantitative analysis revealed increased EGF receptor recycling by 5-fold and reduced degradation by 4-fold in cells overexpressing alphaPIX. In summary, our findings suggest that alphaPIX represents a double switch for controlling EGF receptor fate by accelerating recycling and inhibiting degradation. This data provides new insights in understanding the molecular functions of alphaPIX and underscores the importance of intracellular trafficking mechanisms in neuronal development.

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